Желудочно-кишечный стент, выделяющий пиперлонгумином, с использованием матов из нановолокна, чувствительных к активным видам кислорода, для ингибирования клеток холангиокарциномы

Фон

Холангиокарцинома (ХАК), которая обычно возникает из области желчных протоков, считается одним из наиболее агрессивных видов рака [1,2,3]. Причина канцерогенеза и увеличения заболеваемости до сих пор не ясна, хотя заболеваемость растет во всем мире [1]. Поскольку у большинства пациентов с ОСА часто диагностируется запущенная стадия, очень немногие пациенты с ОСО поддаются хирургической резекции [2]. Для лечения пациентов с ОСО были опробованы различные варианты лечения, такие как лучевая терапия, химиотерапия, смещение металлических стентов и иммунно-адъювантная терапия [3,4,5,6,7,8,9]. Поскольку желчный проток блокируется ростом опухоли или воспалением, смещение стента часто используется для предотвращения окклюзии желчных протоков и продления выживаемости пациента среди вышеупомянутых методов лечения [10, 11]. Однако металлический стент не имеет лечебной функции, а разрастание опухоли внутри стента обычно вызывает обструкцию желчевыводящих путей. Чтобы решить эти проблемы, многие ученые исследовали стенты с лекарственным покрытием (DES) [12,13,14,15]. Например, группа Ли исследовала желудочно-кишечный (ЖКТ) стент, выделяющий паклитаксел, в последнее десятилетие [12,13,14,15]. Хотя стенты, выделяющие паклитаксел, имеют небольшие отличия в проходимости стентов и выживаемости пациентов по сравнению с покрытыми металлическими стентами, они наблюдали приемлемость стентов, выделяющих паклитаксел, в исследовании осуществимости и безопасности на свиньях [13,14,15]. Kim et al. исследовали DES с использованием сорафениба, ингибитора тирозиновой протеинкиназы, против клеток HuCC-T1 CCA с использованием моделей ксенотрансплантата опухоли животных, а стент, выделяющий сорафениб, обладает эффективностью по подавлению роста опухоли на модели ксенотрансплантата опухоли животных [16]. Kwak et al. сообщили, что стент, покрывающий ингибитор гистондеацетилазы (HDAC) (вориностат), эффективно подавляет экспрессию HDAC, индуцирует ацетилированный гистон (Ac-гистон), а затем подавляет рост опухоли на модели мышей с клетками CCA [17]. DES с новым противоопухолевым агентом или молекулярным целевым агентом по-прежнему является привлекательным вариантом для продления выживаемости пациентов. Кроме того, чувствительные к стимулам маты из нановолокон или наноматериалы также были специально исследованы для доставки противоракового агента [18,19,20]. Нановолокна на основе термочувствительных полимеров, таких как поли (ди (этиленгликоль) метилметакрилат простого эфира) (ПДЭГМА) или поли ( N Сополимеры -изопропилакриламид) поли (НИПАМ) могут применяться для высвобождения чувствительных к температуре лекарств в локальном очаге заболевания [18, 19]. Bellat et al. сообщили, что самоорганизующиеся пептидные нановолокна продемонстрировали отличное нацеливание на опухоль с пониженным захватом RES [20].

Дисбаланс между производством АФК и клеточной системой антиоксидантной защиты при заболевании широко исследовался в биомедицинской области [21,22,23,24]. В частности, окислительный стресс при раке также широко исследовался и применялся в системах доставки лекарств, чувствительных к окислительно-восстановительным процессам [23,24,25]. Например, тиоэфирные группы в основной цепи полимера наночастиц могут быть изменены с гидрофобных на гидрофильные при воздействии АФК, а наночастицы с возможностью переключения АФК могут применяться при заболеваниях в среде, богатой АФК [25, 26]. Yu et al. сообщили, что специфическая эндосомная доставка в раковые клетки может быть достигнута с помощью полимерных мицелл, реагирующих на АФК, т. е. сополимер может быть преобразован из гидрофобного в гидрофильный в среде, богатой АФК, и это явление индуцировало быстрое высвобождение противоопухолевого препарата после более высокой противораковой активности [27]. . Мы также ранее сообщали, что реагирующие на окислительно-восстановительный механизм нанофотосенсибилизаторы специфически выделяют фотосенсибилизатор с глутатионовой (GSH) чувствительностью, а затем индуцируют более высокую генерацию АФК по сравнению с самим фотосенсибилизатором [28]. В недавних исследованиях известно, что полимерные мицеллы, имеющие диселенидную связь, вызывают высвобождение лекарственного средства, инициируемое АФК, за счет распада диселениумных связей и проявляют специфичную для АФК противоопухолевую активность [29]. Наночастицы, запускаемые АФК, считаются многообещающей платформой для противоопухолевой химиотерапии.

Пиперлонгумин (PL), природное химическое вещество, полученное из Piper longum , обладает многообещающей противоопухолевой активностью с низкой цитотоксичностью по отношению к нормальным клеткам [30]. Raj et al. сообщили, что избирательная токсичность PL для раковых клеток обусловлена ​​тем, что PL избирательно продуцирует ROS в раковых клетках по сравнению с нормальными клетками; PL вызывает повреждение ДНК и изменения морфологии / функции митохондрий в раковых клетках [30]. Изучена противоопухолевая активность PL против различных раковых клеток [31,32,33,34,35]. Xiong et al. сообщили, что PL заметно увеличивает ROS, а затем эффективно ингибирует клетки первичного миелоидного лейкоза за счет индукции апоптотических белков [35]. Несмотря на то, что PL имеет низкую токсичность по отношению к нормальным клеткам и органам, она оказывает негативное воздействие на почки [36, 37]. Более того, короткий период полужизни PL в кровотоке также должен быть улучшен [38].

В этом исследовании мы изготовили стент с покрытием из нановолокна, чувствительный к окислительно-восстановительным процессам, и PL был загружен в маты из нановолокна. Для определения окислительно-восстановительной способности был синтезирован блок-сополимер LEse, имеющий диселенидную связь, который был использован для изготовления матов из нановолокон для DES. Повышенное содержание АФК в области опухоли может увеличить скорость высвобождения лекарства и способствовать гибели раковых клеток, опосредованной АФК.

Материалы и методы

Материалы

PL был приобретен в LKT Labs. Co., (Миннесота, США). Поли (L-лактид) (PLA, PLA-0005, молекулярная масса =5000 г / моль по данным производителя) был приобретен у Wako Pure Chem. Co. Ltd. (Осака, Япония). Метоксиполи (этиленликоль) сукцинимидилглутарат (MePEG-NHS, молекулярная масса =5000 г / моль) был приобретен у Sunbio Co. Ltd. (Сеул, Корея). Стент для желчевыводящих путей, покрытый силиконовой мембраной, был получен от M.I. Tech. (Пхёнтхэк, Корея). Поли (ε-капролактон) (PCL, среднечисленная молекулярная масса =80000 г / моль), N-гидроксисукцинимид (NHS), N- (3-диметиламинопропил) -N'-этилкарбодиимид гидрохлорид (EDAC), тетрагидрофуран (THF), хлороформ , диметилсульфоксид (ДМСО), 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) и дигидрохлорид селеноцистамина были приобретены у Sigma-Aldrich Chemical Co., (Сент-Луис, Миссури). , США). Диализная мембрана или устройство для диализа (пороговая величина молекулярной массы (MWCO) 1000 г / моль и 8000 г / моль) была приобретена у Spectrum / Por Lab., Inc. (Калифорния, США). Все органические растворители и другие химические вещества использовались как особо чистые. Расходные материалы для клеточных культур, такие как среда RPMI1640 и фетальная бычья сыворотка (FBS), были приобретены у Life Tech. Inc. (Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Все использованные реагенты и органические растворители были пригодны для ВЭЖХ.

Синтез блочного сополимера LEse

Конъюгаты MePEG-селеноцистамин

MePEG-NHS (500 мг) растворяли в 20 мл ДМСО. Более пяти эквивалентов селеноцистамина отдельно растворяли в 15 мл деионизированной воды и смешивали с 5 мл ДМСО. После этого раствор селеноцистамина медленно добавляли по каплям к раствору MePEG-NHS и затем перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 24 часов. После этого реагенты вводили в диализную трубку (MWCO 1000 г / моль) и затем диализовали против большого количества воды в течение 2 дней. Диализированный раствор лиофилизировали 2 дня. Лиофилизированное твердое вещество использовали для синтеза блок-сополимера.

Синтез блок-сополимера

PLA (500 мг) растворяли в 20 мл ДМСО с эквивалентным количеством EDAC и NHS. Этот раствор перемешивали на магнитной мешалке в течение 12 часов. К этому раствору добавляли твердый мПЭГ-селеноцистамин (530 мг) и дополнительно перемешивали в течение 2 дней. После этого реагенты вводили в диализную трубку (MWCO:8000 г / моль) и затем диализовали против большого количества воды в течение 2 дней. Диализированный раствор лиофилизировали 2 дня. Лиофилизированные продукты осаждали в метаноле, чтобы еще раз удалить непрореагировавший мПЭГ-селеноцистамин. Конечная доходность составила более 94%. Выход =[(масса лиофилизированного твердого вещества) / (масса PLA + масса мПЭГ-селеноцистамина)] × 100.

Характеристика полимеров

Чтобы контролировать синтез полимера, ¹ Использовалась спектроскопия H-ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Полимеры растворяли в форме ДМСО-d и измеряли с помощью ¹ H-ЯМР-спектроскопия (Сверхпроводящий FT-ЯМР-спектрометр, 500 МГц, UnityInova 500, Varian Inc., Agilent Tech., Калифорния, США).

Молекулярный вес полимеров измеряли с помощью гель-проникающей хроматографии (GPC, система Waters GPC, MA 01757, США):насос для растворителя Waters 1515 HPLC, детектор показателя преломления Waters 2414 и три колонки Waters Styragel High Resolution (HR4, HR2, HR1). ). Полимеры растворяли в ТГФ особой чистоты, содержащем 0,1 н. LiBr в качестве элюента (скорость потока 1,0 мл / мин). Для построения калибровочной кривой использовались полистиролы.

Нановолоконные коврики из PL и покрытие на стенке GI

Коврики из нановолокна с наполнителем из PL

Вориностат (100 мг) растворяли в 10 мл раствора ацетона. К этому раствору затем добавляли LEse (100 ~ 400 мг) и PCL (600 ~ 900 мг) и перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 2 часов. Этот раствор использовали для изготовления матов из нановолокон и нанесения покрытия на стент, покрытый силиконовой мембраной, с использованием машины для электропрядения (EBS ES-Biocoater; Nano NC, Сеул, Южная Корея). Электропрядильная машина состоит из высоковольтного источника питания, шприцевого насоса, роботизированной системы X-Y и барабанного коллектора. Раствор полимер / лекарственное средство в шприце (NanoNC, 24G) распыляли на покрытый силиконовой мембраной металлический стент (диаметр 1 см, длина 10 см, скорость вращения 500 об / мин, скорость распыления 100 мкл / минуту, напряжение 15 кВ), что соответствует помещается на прокатный коллектор. На стент была нанесена мембрана из нановолокна, наполненная PL. Чтобы удалить оставшийся растворитель, стент с покрытием из нановолокна с PL сушили в вакуумной сушильной печи в течение 24 часов. Стенты с покрытием из нановолокна, наполненного PL, хранили при 4 ° C до следующего исследования.

Маты из нановолокна, наполненные PL, осторожно отделяли от стента для высвобождения лекарственного средства и исследования на животных. Пустая мембрана из нановолокна была приготовлена ​​в отсутствие PL по аналогичной процедуре.

Содержание лекарственного средства измеряли следующим образом:5 мг матов из нановолокон, содержащих PL, растворяли в ДМСО в течение 2 часов. УФ-спектрофотометр (UV-1601, Shimadzu Co. Ltd. Осака, Япония) использовали для измерения концентрации лекарственного средства при 325 нм. Пустые маты из нановолокна также растворяли в ДМСО и использовали для холостого теста.

Исследование высвобождения лекарства проводили с фосфатно-солевым буфером (PBS, 0,01 M, pH 7,4) in vitro. Маты из нановолокна разрезали на диски и 10 мг дисков погружали в 40 мл PBS (0,01 M, pH 7,4) в конической пробирке на 50 мл. Его помещали в инкубатор со встряхиванием при 100 об / мин (37 ° C). Целые среды были взяты для измерения концентрации высвобожденной PL из матов из нановолокна в определенные промежутки времени. Концентрацию ФЛ в среде измеряли УФ-спектрофотометром (325 нм). Пустые маты из нановолокна также использовали в качестве холостого теста. В исследовании высвобождения в среду высвобождения добавляли перекись водорода, чтобы исследовать влияние ROS на скорость высвобождения лекарства.

Морфология

Морфологию матов из нановолокон наблюдали с помощью автоэмиссионного сканирующего электронного микроскопа (S-4800; Hitachi, Токио, Япония) при 25 кВ.

Культура клеток

Линии клеток CCA человека, такие как SNU478, SNU245 и SNU 1196, линии клеток CCA были получены из Korean Cell Line Bank (Сеул, Корея). Клеточная линия человеческого CCA HuCC-T1 была получена из банка ресурсов исследований в области здравоохранения (Осака, Япония). Все клетки культивировали в RPMI1640 с добавлением 10% инактивированного нагреванием FBS и 1% пенициллина / стрептомицина при 37 ° C в 5% CO ₂ инкубатор.

Исследование противораковой активности

Различные ячейки CCA (1 × 10 ⁴ ), засеянные в 96-луночные планшеты, использовали для оценки противоопухолевой активности самого PL, матов из нановолокон, содержащих PL, или PL, высвобожденных из матов из нановолокон. Клетки выдерживали в течение ночи в 5% CO ₂ инкубатор при 37 ° C. Для обработки PL, PL, растворенный в ДМСО (10 мг PL / мл ДМСО), разбавляли средой RPMI1640. Конечная концентрация ДМСО была ниже 0,5%. Для лечения PL, высвобождаемого из матов из нановолокон, маты из нановолокон, содержащих PL, погружали в 40 мл PBS в коническую пробирку на 50 мл. На 5-й и 15-й день измеряли концентрацию PL с помощью УФ-спектрофотометра, как описано выше, и использовали для обработки клеток. Пустое нановолокно также было адаптировано к эксперименту по высвобождению для сравнения. Клетки подвергали воздействию самого PL или PL, высвобожденного из матов из нановолокон, в течение 2 дней. Жизнеспособность клеток CCA оценивали с помощью анализа пролиферации МТТ. В лунки добавляли 30-микролитровый раствор МТТ (5 мг / мл PBS, pH 7,4), а затем клетки инкубировали в течение 4 часов в 5% CO ₂ инкубатор при 37 ° C. Среду отбрасывали и добавляли 100 мкл ДМСО. Жизнеспособность клеток анализировали с помощью микропланшет-ридера при 570 нм (микропланшетный ридер Infinite M200 Pro, Tecan, Маннедорф, Швейцария). Жизнеспособность клеток выражали как среднее значение ± стандартное отклонение для восьми лунок.

Измерение ROS

Генерацию АФК в клетках CCA определяли методом DCFH-DA. Ячейки CCA (1 × 10 ⁴ клетки), посеянные в 96-луночный планшет, обрабатывали различными концентрациями самого PL или PL, высвобожденного из матов из нановолокон, в среде RPMI без фенолового красного с DCFH-DA (конечная концентрация 20 мкМ). Через шесть или 12 часов клетки дважды промывали PBS и заменяли 100 мкл свежей среды RPMI, не содержащей фенола красного. Содержание АФК в клетках анализировали по изменению интенсивности флуоресценции с использованием микропланшетного ридера Infinite M200 pro (длина волны возбуждения 485 нм, длина волны излучения 535 нм).

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг клеток CCA проводили, как описано ранее [31]. Клетки подвергали действию самой PL или PL, высвобожденной из матов из нановолокон, в течение 24 часов. После этого клетки собирали трипсинизацией, промывали холодным PBS и собирали центрифугированием. Гранулы лизировали в буфере для лизиса, содержащем 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолевую кислоту, 0,1% додецилсульфат натрия (SDS) с фенилметилсульфонилфторидом и коктейль ингибиторов протеаз (Roche Diagnostics, Базель, Швейцария ). Этот раствор центрифугировали в течение 30 минут при 4 ° C (14000 × g ); лизаты клеток (супернатант) затем использовали для измерения концентрации белка с использованием набора BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, USA). Белок (50 мкг) загружали в электрофорез в SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE), переносили на поливинилдифторидную (PVDF) мембрану, блокировали 5% обезжиренным молоком в TBS-T, зондировали подходящим первичным антителом и затем обрабатывали. с вторичным антителом, конъюгированным с HRP, в течение 1 часа. Иммуноблоты детектировали с помощью хемилюминесценции, а затем количественно оценивали с помощью цифрового анализа с использованием программы ImageJ.

Исследование in vivo с использованием модели ксенотрансплантата опухоли

Мышей, несущих HuCC-T1 (голая мышь BALB / c, возраст 5 недель, самцы, вес 18–23 г; Ориент, Соннам, Южная Корея), использовали для оценки противоопухолевой активности in vivo стента из нановолокна, содержащего PL. 1 × 10 ⁶ Клетки HuCC-T1 в 100 мкл PBS вводили подкожно (п / к) спине голых мышей. Диски из нановолокна с включенным PL и пустого нановолокна имплантировали под солидную опухоль, когда солидная опухоль становилась примерно 4-5 мм в диаметре. Доза PL составила 10 мг PL / кг. Для сравнения, PL растворяли в растворе смеси Cremophor EL® / этанол (0,5% об. / v Cremophor EL® и 0,5% об. / v этанол в PBS (pH 7,4, 0,01 М)). Контрольным группам вводили подкожно PBS рядом с опухолевой тканью. Для нановолокон, содержащих PL, и пустой группы нановолокон, диски из нановолокон готовили следующим образом; Пластины из нановолокна одинакового веса разрезали на круглые диски, а затем осторожно вырезали заднюю часть кожи мыши (длиной 0,5 см). После этого пластины из нановолокна были осторожно имплантированы под ткань твердой опухоли. Чтобы добиться равных условий, у мышей с контрольной обработкой и инъекцией PL также иссекали кожу рядом с опухолью (длиной 0,5 см). Каждая группа состояла из пяти мышей. Объем опухоли измеряли с интервалами в 5 дней, и первый день имплантации нановолокна был установлен как день 0. Объем опухоли рассчитывали по следующему уравнению: V =( а × [ b ] ² ) / 2. а :наибольший диаметр; б :наименьший диаметр.

Все исследования на животных были тщательно выполнены в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу и использованию животных Пусанского национального университета (PNUIACUC). Протокол на животных, использованный в этом исследовании, был строго рассмотрен PNUIACUC в отношении их этических процедур и научного ухода, и он был одобрен (Номер одобрения:PNU-2017-1608).

Иммуногистохимия

Ткани опухоли были изолированы через 30 дней. Затем ткани опухоли фиксировали в 4% формальдегиде, заливали парафином и делали срезы для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). Иммуногистохимическое окрашивание проводили с белками, связанными с апоптозом, такими как антитела к каспазе-3 и каспазе-9. Антитела использовали в разведении 1:100 или 1:200, а затем проводили окрашивание с использованием набора Envision (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя.

Статистический анализ

Статистический анализ данных для обработанных и необработанных клеток был выполнен с использованием t Стьюдента. контрольная работа. А п значение <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Характеристика полимеров

Для изготовления стента GI, элюирующего PL, синтезировали блок-сополимер LEse, как показано на фиг. 1. MePEG-NHS реагировал с селеноцистамином, а затем концевую аминогруппу конъюгировали с концевой карбоксильной группой PLA. Непрореагировавший селеноцистамин из конъюгатов MePEG-селеноцистамин удаляли процедурой диализа. Кроме того, непрореагировавшие конъюгаты MePEG-селеноцистамин из синтезированного блок-сополимера также удаляли с помощью процедуры диализа и осаждения в метаноле. Специфические пики селеноцистамина были подтверждены при 1,7 и 2,9 промилле, соответственно, в то время как специфический пик MePEG также был подтвержден при 3,5 ~ 3,7 промилле. Когда PLA конъюгировали, метильная группа PLA была подтверждена при 1,4 м.д. Смесь гомополимера PCL и блок-сополимера LEse смешивали для изготовления матов из нановолокон. ММ и состав блок-сополимера LEse и гомополимера PCL измеряли с ¹ H-ЯМР-спектроскопия и ГПХ. Результаты оценки ММ были показаны в Таблице 1. Как показано в Таблице 1, ММ блок-сополимера LEse оценивали на основе ММ ПЭГ с использованием ¹ Спектроскопия H-ЯМР 9760 г / моль. Измерения методом ГПХ показали, что блок-сополимер LEse содержит 8210 г / моль Mn, 9530 г / моль Mw и 1,16 соответственно.

Схема синтеза блок-сополимера LEse

Характеристика желудочно-кишечного стента, содержащего пиперлонгумин, покрытого нановолокном

Как показано на рис. 2 и в таблице 2, различные соотношения блок-сополимера PCL и LEse использовались для изготовления нановолокна и нанесения покрытия на стент GI. Гомополимер PCL привел к получению тонких и тонких матов из нановолокон с минимизированной агрегированной формой. Когда был добавлен блок-сополимер LEse, наблюдалась некоторая агрегированная форма, такая как гранулы и частицы, как показано на рис. 2. При более высоком соотношении LEse (75/25 и 60/40) маты из нановолокон отображали более толстую и неправильную форму волокнистых материалов. структура. Когда в их содержании содержалось более 50% LEse, полимеры были значительно агрегированы, и маты демонстрировали серьезную неравномерность (данные не показаны). Нановолоконную структуру трудно получить только из одного блок-сополимера LEse. Следовательно, нановолоконная структура может быть получена путем смешивания с гомополимером PCL. Содержание лекарственного средства в подготовленных матах из нановолокон, содержащих PL, было почти аналогично теоретическому значению, как показано в таблице 2. Эти результаты показали, что маты из нановолокон, содержащих PL, были успешно изготовлены из смесей гомополимеров PCL и блок-сополимеров LEse, а затем нанесены на стент GI.

а Стент GI с включенным PL, покрытым нановолокном. б Фотография FE-SEM нановолокна, содержащего PL

На рис. 3 показана кинетика высвобождения лекарственного средства из матов из нановолокна. Как показано на рис. 3а, PL непрерывно высвобождается из матов из нановолокна в течение 25 дней. Всплеск высвобождения PL из матов из нановолокон наблюдался до 4 дней, а затем PL непрерывно высвобождался из матов из нановолокон до дня 25. Более высокое содержание блок-сополимера LEse в матах из нановолокон приводило к более быстрому высвобождению PL из матов из нановолокон. Поскольку блок-сополимер LEse менее гидрофобен, чем гомополимер PCL, маты из нановолокон PCL / LEse с более высоким содержанием блок-сополимера LEse должны набухать больше, чем гомополимер PCL. Затем маты из нановолокна с более высоким содержанием блок-сополимера LEse приводили к более быстрому высвобождению лекарственного средства. Кроме того, скорость высвобождения PL может быть увеличена в присутствии ROS, поскольку диселенидная связь в блок-сополимере LEse может разрушаться с помощью ROS, таких как H ₂ О ₂ , а затем эти факторы вызывают окислительно-восстановительное разрушение матов из нановолокон (рис. 3c ~ e). Маты из нановолокна из гомополимера PCL не реагировали в значительной степени на добавление H ₂ О ₂ , т.е. H ₂ не сильно влияет на PCL О ₂ добавление; с другой стороны, когда добавляли блок-сополимер LEse, высвобождение PL из матов из нановолокон значительно ускорялось, поскольку H ₂ О ₂ был добавлен . В частности, более высокое соотношение блок-сополимера LEse в матах из нановолокон индуцировало более быструю кинетику высвобождения лекарственного средства, как показано на фиг. 3c, d и e. Эти результаты показали, что маты из нановолокон, содержащих PL, обладают способностью к высвобождению лекарственного средства в биологической среде в зависимости от окислительно-восстановительного потенциала. Маты из нановолокон, содержащих PL, приготовленные с блок-сополимером PCL / LEse (60/40), использовали после культивирования клеток in vitro и исследования на животных in vivo.

а Высвобождение ФЛ из нановолокон различного состава. Соотношение масс PCL / Lese составляло 100/0, 90/10, 75/25 и 60/40 соответственно. б Влияние перекиси водорода на высвобождение PL из матов из нановолокна (весовое соотношение PCL / Lese составляло 100/0). c Влияние перекиси водорода на высвобождение PL из матов из нановолокна (весовое соотношение PCL / Lese составляло 90/10). г Влияние перекиси водорода на высвобождение PL из матов из нановолокна (весовое соотношение PCL / Lese составляло 75/25). е Влияние перекиси водорода на высвобождение PL из матов из нановолокна (весовое соотношение PCL / Lese составляло 60/40)

Противораковая активность in vitro

Противораковые свойства стента, покрытого матом из нановолокна с PL, оценивали с использованием различных клеток CCA. Для сравнения, PL, высвобожденный из матов из нановолокон, экстрагировали на 5-й и 15-й день во время эксперимента по высвобождению и сравнивали с интактным PL. Как показано на фиг. 4, противораковая активность высвобожденной PL с 5-го и 15-го дня существенно не изменилась по сравнению с самой PL у всех клеток HuCC-T1 (фиг. 4a), клеток SNU1196 (фиг. 4b), клеток SNU478 ( Рис. 4c) и ячейки SNU245 (Рис. 4d). Они обладают почти одинаковым потенциалом ингибирования жизнеспособности клеток, хотя сама PL приводит к более высокой противораковой активности при концентрации выше 10 мкг / мл. В таблице 3 показаны ИС ₅₀ стоимость самого PL и высвобождаемого PL из матов из нановолокна. Как и сама PL, высвобожденная PL с 5-го и 15-го дня сохраняла противоопухолевую активность до 15 дней эксперимента по высвобождению лекарственного средства и показывала разумный IC ₅₀ значение для всех клеточных линий CCA, хотя эти значения постепенно увеличивались на PL, начиная с 5-го и 15-го дня, по сравнению с самим PL. Высвобождение PL с 4-го и 15-го дня в присутствии H ₂ О ₂ также сохранял противоопухолевую активность, как и сам PL. Эти результаты показали, что противораковая активность PL сохраняется во время процесса изготовления нановолокон и периода высвобождения лекарственного средства в биологической среде. Кроме того, высвобожденная PL из матов из нановолокна вырабатывала способность генерировать ROS до 15 дней периода высвобождения лекарства, как и сама PL (рис. 5). Как показано на фиг. 5a и b, сама PL вырабатывала значительно больше АФК при более высокой скорости, чем 5 мкг / мл. Высвобожденная PL с 5-го и 15-го дня также вырабатывала ROS, хотя продукция ROS была немного снижена из-за высвобождения PL с 15-го дня, что указывает на то, что маты из нановолокон, содержащих PL, сохраняли собственные противораковые свойства PL в течение периода высвобождения лекарственного средства.

Влияние PL и высвобожденной PL из матов из нановолокон на жизнеспособность различных клеток ОСК. а HuCC-T1, b SNU1196, c SNU478 и d Клетки холангиокарциномы SNU245. 2 × 10 ⁴ клетки в 96-луночных планшетах подвергали воздействию PL или высвобождали PL из нановолокон в течение 2 дней. Для лечения высвобожденного PL диски из нановолокон, содержащих PL, погружали в PBS, а затем проводили эксперимент по высвобождению в течение 5 и 15 дней с 10 мМ H ₂ или без него. О ₂ . Среду меняли до 3 дней, как и при исследовании высвобождения лекарственного средства. После этого среду собирали между 5 и 15 днями эксперимента по высвобождению. Этот раствор был использован для исследования сравнения противоопухолевой активности самого PL и высвобожденного PL

Влияние PL и высвобожденной PL из матов из нановолокон на генерацию ROS в клетках HuCC-T1 ( a ) и ячейки SNU245 ( b ). Обработка самого PL и высвобожденного PL проводилась, как описано на рис. 3

На фигуре 6 показана экспрессия белка апоптоза в клетках ССА HuCC-T1. Высвобожденный PL (5 дней) имеет аналогичную активность в индукции апоптоза клеток HuCC-T1 по сравнению с самим PL, то есть экспрессия BAX, каспазы-3, 7 и 9, и расщепление расщепленного PARP постепенно увеличивалось обработкой выпустил PL (5 дней), а также сам PL. Эти результаты также показали, что высвобожденный PL обладает разумной противораковой активностью в отношении клеток CCA, а также самого PL.

Вестерн-блоттинг апоптоза клеток HuCC-T1. Клетки обрабатывали самим PL или высвобождали PL из нановолокон в течение 1 дня, а затем выполняли вестерн-блот-анализ

Противораковая активность in vivo в отношении модели ксенотрансплантата опухоли HuCC-T1

Бестимусных мышей, несущих HuCC-T1, готовили для оценки in vivo противоопухолевой активности стента, покрытого нановолокном, с включенным PL, как показано на фиг. 7 и 8. Как показано на фиг. 7, объем опухоли HuCC-T1 постепенно увеличивался в течение 1 месяца. Рост объема опухоли при обработке пустого нановолокна был почти таким же, как и при контрольной обработке. Инъекция PL должным образом подавляла рост опухоли по сравнению с контрольной обработкой или обработкой пустым нановолокном. Especially, tumor growth was significantly inhibited by the treatment of PL-incorporated nanofiber, i.e., tumor mass in the treatment of PL-incorporated nanofiber was one third of control treatment. These results indicate that PL-incorporated nanofiber mats have superior potential in inhibition of tumor growth of CCA cells. Furthermore, the expression of caspase-3 and 9 was also increased in tumor tissues as shown in Fig. 8, indicating that released PL from nanofiber mats properly inhibited the growth of the tumor and induced apoptosis of tumor cells. Also, PL-incorporated nanofiber-coated stent has potential to inhibit CCA cells in vitro and in vivo.

The effect of PL solution, empty nanofiber mats or PL-incorporated nanofiber mats on the growth of HuCC-T1 tumor (a ) and the body weight changes (b ). HuCC-T1 (1 × 10 ⁶ cells) cells were implanted to the back of mice. PL dose was adjusted to 10 mg/kg. One hundred microliters of PBS or PL solution was s.c. injected beside the tumor tissue for control treatment and PL solution treatment, respectively. For empty nanofiber and vorinostat nanofiber implantation, wafers of the same weight were cut and then implanted under the tumor tissue. * p <0,001; ** p <0,01

Immunohistochemical staining (× 400) of HuCC-T1 tumor tissues. Each tumor tissues were stained with BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP-1

Discussion

Abnormal accumulation of ROS in tumor epithelial cells induces carcinogenesis and affects surrounding cells or tissues which constitute tumor microenvironment [39]. Then, abnormal tumor microenvironment is the key player in proliferation, migration, angiogenesis, and metastasis of cancer cells [39,40,41]. An elevated level of ROS in tumor microenvironment induces oxidative stress and causes DNA damage [39]. Also, ROS is also correlated with cholangiocellular proliferation and oncogenic transformation [42]. Paradoxically, increased accumulation of intracellular ROS over toxic level induces apoptosis of cancer cells and tumor suppression [39,40,41,42]. For example, Thanee et al. reported that sulfasalazine as a cystine-glutamate transporter-target drug increased intracellular ROS level and then induced cell death [43]. They also argued that therapeutic efficacy of anticancer drug can be improved by blocking the mechanism of the cell’s ROS defensive system. Also, many research groups investigated ROS-producing small molecules such as melatonin, luteolin, chloroqine, and PL to suppress CCA growth rate by increasing intracellular ROS [44,45,46,47]. Thongsom et al. reported that PL stimulates ROS accumulation in CCA cells and induces cell death by activation of caspase-3 and PARP [47]. We also observed that PL increases the accumulation of intracellular ROS in various CCA cells as shown in Fig. 5. Increased ROS level induced apoptosis signals such as BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP (Fig. 6). The ROS-producing capability of piperlongumine was slightly decreased on day 5 and 15 as shown in Fig. 5. These results might be due to that piperlongumine is unstable in physiological solution, and then ROS-producing capability might have been slightly decreased. Additionally, physicochemical properties of piperlongumine may be affected during the fabrication process of the nanofiber. However, our results showed that ROS-producing capacity of piperlongumine was still maintained during the 15 days of drug release experiment.

Local treatment can be applied for patients with an advanced stage or unresectable stage of CCA [48]. Among various treatment options, DES is a promising candidate for unresectable CCA patients. However, conventional DES for GI tract has no tumor-targetable drug release function, and cytotoxic agent can be eluted in all areas of polymer membrane on the stent. Chemical, physical, or biological stimuli have been applied to induce altered drug delivery in the local region [49,50,51,52]. For example, Wang et al. used a magnitude of applied tensile strain to control drug release rate on the esophageal stent, i.e., increased drug release in a specific region was observed by propagating patterned crack of multilayered coating on the stent [49]. Thin film or nanoporous devices having stimuli-responsiveness such as pH and ionic strength were also investigated for application in DES [50, 51]. Chen and Huang reported that chitosan/poly(vinyl alcohol) hybrid nanofiber membrane was crosslinked with ally disulfide to endow reductant-responsiveness, and then hybrid nanofiber membrane showed favorable biological/material features [52]. We synthesized LEse deblock copolymer and fabricate redox-responsive nanofiber mats for local application in CCA tumors. PCL/LEse-blended nanofiber mats showed increased drug release behavior with responsiveness against H₂ О ₂ , indicating that drug release kinetics can be controlled by ROS level in cancer cells or tumor tissues. Furthermore, ROS-dependent drug release from nanofiber mats can be accelerated in tumor since PL is a ROS-producing agent. PL in the tumor may synergistically increase ROS level and then accelerate drug release from nanofiber mats. After all, ROS-dependent release of PL from nanofiber-coated stent synergistically inhibits CCA cells in vitro and in vivo.

Conclusion

We fabricated ROS-sensitive nanofiber mats-coated GI stent using PCL/LEse block copolymer blend. PL was incorporated in nanofiber mats by electrospinning technique. PL release from nanofiber mats was accelerated by addition of H₂ О ₂ , indicating that PL-incorporated nanofiber membranes have ROS-responsiveness. PL released from nanofiber mats at 5 days and 15 days showed appropriate anticancer activity even though its anticancer activity was slightly decreased compared to PL itself. As well as PL itself, PL released from nanofiber mats induced ROS generation and apoptosis of CCA cells. Furthermore, PL-incorporated nanofiber mats properly inhibited the growth of HuCC-T1 tumor in mice. We suggest PL-incorporated nanofiber mats prepared by PCL/LEse block copolymer blend as a promising candidate for local treatment of CCA cells.