Лиофилизированные гибридные наноструктурированные липидные носители для увеличения клеточного поглощения верапамила:статистическая оптимизация и оценка in vitro

Фон

Верапамил является блокатором кальциевых каналов L-типа из класса фенилалкиламинов и антагонистом α-адренергических рецепторов. Он широко используется для лечения гипертонии, наджелудочковой тахиаритмии, стенокардии и кластерных головных болей. Согласно системе классификации биофармацевтики, верапамил относится к препаратам I класса. Известно, что препараты этого класса хорошо всасываются через кишечную мембрану (≤ 90%) после перорального приема. Однако только от 20 до 35% пероральной дозы верапамила попадает в кровоток из-за быстрого метаболизма при первом прохождении через портальную систему кровообращения [1]. Поэтому важно разработать подходящие носители, которые могут усилить захват верапамила клетками и, возможно, улучшить его биодоступность.

Второе поколение нанообразований на основе липидов, таких как наноструктурированные липидные носители (НЖК), продемонстрировало большой потенциал для использования в доставке терапевтических агентов [2, 3]. НЖК обладают более высокой химической и физической стабильностью по сравнению с твердыми липидными наночастицами (SLN), а также обладают свойствами контролируемого высвобождения. Кроме того, НЖК демонстрируют высокую нагрузочную способность для молекул лекарства за счет образования менее упорядоченной кристаллической решетки липидной матрицы, что может минимизировать выброс лекарства во время хранения. НЖК получают из липидов, которые ускоряют образование хиломикронов в кишечнике и способствуют абсорбции НЖК, что может увеличить биодоступность лекарств [4]. Таким образом, в настоящем исследовании были разработаны гибридные наноструктурированные липидные носители верапамил-декстран (HVD-NLC) для улучшения клеточного поглощения препарата, что может привести к увеличению его биодоступности.

Большинство липофильных лекарств могут легко включаться в НЖК, но довольно сложно учесть гидрофильные лекарства, такие как верапамил, в наноформулировке на основе липидов. Таким образом, в настоящем исследовании были приготовлены гибридные НЖК с использованием противоиона декстрансульфата натрия для усиления инкапсуляции верапамила и продления его высвобождения из НЖК (рис. 1). Составы HVD-NLC были приготовлены методом горячей гомогенизации с большим усилием сдвига и статистически оптимизированы с использованием 2 ⁴ полный факторный дизайн. В исследовании использовались два типа липидов:твердый липид Compritol 888 ATO® и жидкий липид олеиновая кислота. Приготовленные HVD-NLC были охарактеризованы по размеру их частиц (PS), дзета-потенциалу (ZP), индексу полидисперсности (PDI) и проценту эффективности захвата лекарственного средства (% EE). Оптимизированные HVD-NLC лиофилизировали с использованием трегалозы в качестве криопротектора. Профили высвобождения in vitro были проведены в щелочной и кислой средах. Исследование клеточного поглощения верапамила из выбранных HVD-NLC проводили с использованием клеточных линий Caco-2. Исследование стабильности оптимизированного состава проводилось в течение 6 месяцев при трех различных условиях (5 ° C ± 3 ° C, 25 ° C ± 2 ° C / 60% RH ± 5% RH и 40 ° C ± 2 ° C / 75% относительной влажности ± 5%).

Образование электростатического комплекса водорастворимого катионного препарата гидрохлорида верапамила и противоионного полимера декстрансульфата натрия

Методы

Материал

Верапамил HCl был приобретен на фармацевтическом заводе Вэньчжоу (Вэньчжоу, Китай). Compritol 888 ATO® (глицериндибегенат EP – глицерилбегенат NF) был получен от Gattefosse (Saint-Priest, France). Олеиновая кислота была закуплена у R&M Chemical (Эссекс, Великобритания). Твин 80® (полисорбат 80) был приобретен в Euro Chemo-pharma Sdn. Bhd. (Пенанг, Малайзия). Полоксамер 188 (Pluronic® F-68) был приобретен у Molekula (Дорсет, Великобритания). Трегалоза, Sephadex® G-25 и фетальная бычья сыворотка (FBS) были получены от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Клеточная линия Caco-2 была получена от ATCC (Вирджиния, США). Раствор пенициллин-стрептомицин 100 X был получен от Biowest (Nuaillé, Франция). Трипсин 0,25% и среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), были закуплены у GE Healthcare Life Sciences, лаборатория Hyclone (Юта, США). Буфер для пассивного лизиса 5X был приобретен у Promega (Висконсин, США).

Методы

Подготовка HVD-NLC

HVD-NLC были приготовлены методом горячей гомогенизации с высоким сдвигом. Липидная фаза состояла из Compritol ATO 888®, и олеиновая кислота плавилась путем нагревания при 85 ° C (на 10 ° C выше точки плавления твердого липида). Требуемое количество верапамила взвешивали и растворяли в водной фазе, содержащей смесь Твина 80® и полоксамера 188 в соотношении 1:1 w / w . Водную фазу нагревали до той же температуры, что и липидную фазу. Водную фазу выливали в липидную фазу и гомогенизировали с использованием цифрового гомогенизатора T25 Ultra-Turrax®, IKA® (Staufen, Германия) при 24000 об / мин, 85 ° C. Затем водный раствор сульфата декстрана (отношение 1:1 к верапамилу) медленно добавляли в смесь во время процесса гомогенизации. Подготовленные HVD-NLC оставляли охлаждаться при комнатной температуре (25 ± 2 ° C).

Статистическая оптимизация параметров формулировки с использованием 2 ⁴ Полнофакторный дизайн и подходы к функциям желательности

Полный факторный план с двумя уровнями и четырьмя переменными был выполнен для оптимизации и оценки влияния независимых переменных (факторов) формулировки на характеристики (зависимые переменные или ответы) (таблица 1). Истинные высокие и низкие уровни для каждой независимой переменной были выбраны на основе предварительных исследований.

Экспериментальные ответы, полученные от зависимых переменных, были результатом индивидуального и комбинированного воздействия четырех независимых переменных. Этот двухуровневый экспериментальный план дает достаточно данных, чтобы соответствовать следующему полиномиальному уравнению.

Где X зависимая переменная; β ₀ это перехват; β ₁ , β ₂ , β ₃ , и β ₄ - коэффициенты при независимых переменных A , B , C , и D соответственно. Пока β ₁₂ , β ₁₃ , β ₁₄ , β ₂₃ , β ₂₄ , и β ₃₄ представляют собой соответствующие взаимодействия (т.е. AB, AC, AD, BC, BD и CD). Результаты экспериментов анализировали с помощью программного обеспечения Design-Expert® версии 6.0.10 (Stat-Ease, Inc., Миннеаполис, Миннесота, США) с последующим дисперсионным анализом (ANOVA) для определения значимости факторов и их взаимодействия. Статистический анализ считался значимым, когда p значения были <0,05.

Окончательные составы были отобраны на основе подхода функции желательности. Функция желательности объединяет все ответы в одну переменную, чтобы предсказать оптимальные уровни изучаемых факторов. Таким образом, было определено желательность выбора оптимизированных составов с наименьшим размером частиц (PS) и индексом полидисперсности (PDI) и наивысшими значениями дзета-потенциала (ZP) и процентной эффективности улавливания (% EE). Функция желательности преобразует все ответы в общую шкалу (0, 1) и объединяет их по среднему геометрическому для оптимизации общей метрики. Значение желательности 1 обозначает приемлемое значение (наиболее желаемое значение) для ответов, а значение желательности 0 указывает неприемлемое значение.

Измерения размера частиц, индекса полидисперсности и дзета-потенциала

PS и PDI полученных наночастиц измеряли с помощью фотонно-корреляционного спектрометра (Zetasizer 1000HS / 3000HS, Malvern Instrument, Malvern, UK). ZP определяли с использованием анализатора дзета-потенциала (серия Zetasizer nano, значок Nano Z-red, Malvern Instrument, Малверн, Великобритания). Все образцы были разбавлены фильтрованной дистиллированной водой (нейлоновый фильтр 0,45 мкм), и измерения были выполнены в трех экземплярах.

Определение процента эффективности захвата

Подготовленный образец, содержащий свободный комплекс верапамил-декстран и HVD-NLC, разделяли методом центрифугирования на мини-колонке с использованием Sephadex® G25. Объем образца 1 мл помещали в верхнюю часть колонки, а затем центрифугировали в течение 2 мин при 2000 об / мин. Элюент, содержащий HVD-NLC, собирали и лиофилизировали с использованием сублимационной сушилки (Labconco, Free Zone Freeze Dry Systems, Канзас-Сити, США).

Лиофилизированные HVD-NLC (10 мг) растворяли в хлороформе и упаривали в атмосфере азота при 40 ° C. Затем высушенный образец растворяли в 1 мл дистиллированной воды, встряхивали в течение 2 мин и центрифугировали (Eppendorf, Германия) при 12000 об / мин в течение 5 мин. Собирали супернатант и определяли количество верапамила с использованием утвержденного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). % EE был рассчитан с использованием следующего уравнения:

Анализ ВЭЖХ для количественного определения верапамила выполняли с использованием хроматографической системы Shimadzu, оснащенной насосом подачи LC 20AD (Киото, Япония) и колонкой Phenomenex C18 (250 × 4,6 мм). Подвижная фаза состояла из 20 мМ ацетата аммония и ацетонитрила в соотношении 40:60 ( v / v ). PH подвижной фазы доводили до pH 6,5 ледяной уксусной кислотой. Объем инъекции составлял 20 мкл, длина волны обнаружения верапамила была установлена ​​на 278 нм, а скорость потока была зафиксирована на уровне 1,5 мл / мин.

Исследование лиофилизации

Лиофилизацию проводили при -40 ° C в течение 24 ч с использованием Labconco, FreeZone Freeze Dry Systems (Канзас-Сити, США). Были проверены пять типов обычно используемых сахаров, включая маннит, фруктозу, сахарозу, лактозу и трегалозу при соотношении липид:криопротектор 1:1, чтобы выбрать подходящий криопротектор для лиофилизации HVD-NLC. Криопротектор, который давал самые низкие средние значения PS и PDI лиофилизированной композиции после восстановления в дистиллированной воде, был выбран для дальнейшего исследования.

В следующем исследовании состав HVD-NLC был смешан с выбранным криопротектором двумя способами. В первом методе криопротектор добавляли после приготовления состава HVD-NLC, и он был назван «после процесса гомогенизации». Во втором методе криопротектор добавлялся во время приготовления состава HVD-NLC, и он был назван «во время процесса гомогенизации». В первом методе были приготовлены и лиофилизованы несколько липидов и соотношений криопротекторов 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 и 1:8. Лиофилизированные составы HVD-NLC повторно диспергировали в фильтрованной дистиллированной воде (нейлоновый фильтр 0,45 мкм), и образцы оценивали на средние значения PS, PDI и% EE. Соотношения липид:криопротектор, которые давали самые низкие PS и PDI и самый высокий% EE, были выбраны для дальнейших исследований во втором методе смешивания.

Исследование выпуска In Vitro

Исследование высвобождения верапамила из НЖК in vitro проводили с использованием диализного мешка, помещенного в среду, имитирующую кишечную жидкость (pH 6,8) или среду, имитирующую желудочный сок (pH 1,2). В этом исследовании 2 мл дисперсии HVD-NLC были помещены в диализный мешок (пороговая мощность 12000 Да). Мешок герметично закрывали и затем погружали в 150 мл предварительно нагретой высвобождающей среды. Исследование высвобождения проводили на магнитной мешалке с горячей пластиной, установленной на скорость перемешивания 100 об / мин и температуру 37 ° C. Через запланированные интервалы времени 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48 и 72 ч отбирали 1 мл образца и заменяли тем же объемом свежей среды. Высвобожденную концентрацию верапамила определяли с помощью ВЭЖХ.

Дифференциальная сканирующая калориметрия

Анализ дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) проводили с использованием ДСК Perkin-Elmer Pyris 6 (Perkin-Elmer, Биконсфилд, Великобритания). Образцы взвешивали (5–7 мг) в алюминиевом поддоне и герметично закрывали с помощью стандартного пресса для обжима поддонов (Perkin-Elmer, Биконсфилд, Великобритания). Кривые ДСК записывали со скоростью 10 ° C / мин от 0 до 260 ° C.

Широкоугольное рентгеновское рассеяние

Θ / 2θ-анализ методом широкоугольного рентгеновского рассеяния (WAXS) проводили при комнатной температуре с использованием PANalytical X’Pert PRO MRD PW3040 (Алмело, Нидерланды) с применением излучения Cu Kα. Образцы обрабатывались в диапазоне температур 2–60 ° C со скоростью сканирования 5 ° C / мин.

Просвечивающий электронный микроскоп и растровый электронный микроскоп

Морфологию (т.е. форму и размер) HVD-NLC наблюдали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ) с использованием (Philips CM12, Эйндховен, Нидерланды). Каплю разбавленной дисперсии HVD-NLC помещали на медную сетку 400 меш с последующим отрицательным окрашиванием 2% фосфорновольфрамовой кислотой. Подготовленный образец сушили на воздухе перед исследованием просвечивающим электронным микроскопом.

Морфологию лиофилизированных HVD-NLC наблюдали с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM) (Leo Supra 50 VP field Emission SEM, Оберкохен, Германия). Образец лиофилизированного HVD-NLC фиксировали на алюминиевом стержне, затем покрывали золотом (толщиной 10 нм) в устройстве для распыления при 15 мА в течение 15 мин. Образец визуализировали с помощью системы энергодисперсионного рентгеновского микроанализа Oxford INCA с ускоряющим напряжением 10 кВ.

Использование сотовых сетей HVD-NLC

Исследование клеточного поглощения верапамила из состава HVD-NLC in vitro исследовали с использованием клеточной линии Caco-2. Клетки культивировали в среде для выращивания DMEM с добавлением 1% раствора пенициллина-стрептомицина и 10% FBS в колбе для тканевой культуры Т-25. Затем клетки Caco-2 собирали и высевали в 48-луночные планшеты при плотности 60000 клеток на лунку с полной средой DMEM до тех пор, пока клетки не становились конфлюэнтными и не образовывали монослой на дне планшета с лунками. Несколько растворов, содержащих такую ​​же концентрацию верапамила, были приготовлены путем разбавления HVD-NLC, раствора верапамила и комплекса верапамил-декстран только средой DMEM. Раствор верапамила и комплекс верапамил-декстран использовали в качестве контроля. Затем полную среду DMEM монослоя клеток Caco-2 в 48-луночных планшетах заменяли различными разведениями HVD-NLC, раствором верапамила и комплексом верапамил-декстран и инкубировали при 37 ° C в течение 6 часов. После завершения инкубационного периода образцы HVD-NLC, раствора верапамила и комплекса верапамил-декстран удаляли из лунок. Остатки тестируемых образцов и мертвые клетки удаляли из монослоев путем трехкратной промывки физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS). Клетки монослоя лизировали, добавляя пассивный лизисный буфер (200 мкл) в каждую лунку для образца. Образцы отбирали пипеткой и центрифугировали при 12000 об / мин в течение 10 минут для извлечения верапамила из клеток. Собирали супернатанты и количественно определяли концентрацию верапамила с помощью ВЭЖХ.

Исследование краткосрочной стабильности

Исследование краткосрочной стабильности оптимизированной рецептуры HVD-NLC проводилось в соответствии с рекомендациями Q1A (R2) международного совета по гармонизации технических требований к фармацевтическим препаратам для человека (ICH). Свежеприготовленный лиофилизированный состав HVD-NLC (VER-9) помещали в три различных условия (5 ± 3 ° C, 25 ± 2 ° C / 60 ± 5% относительной влажности (RH) и 40 ± 2 ° C / 75%). ± 5% относительной влажности) в течение 6 месяцев. Стабильность оптимизированного состава HVD-NLC была исследована путем измерения PS, PDI, ZP и общего содержания лекарственного средства через 0, 1, 3 и 6 месяцев.

Статистический анализ

Результаты были проанализированы с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным методом Tukey-HSD. Статистический анализ выполняли с использованием статистического программного обеспечения IBM® SPSS® (версия 22, Нью-Йорк, США). Все значения были выражены как среднее значение и стандартное отклонение (среднее ± стандартное отклонение). Разница была статистически значимой, когда p <0,05.

Результаты и обсуждение

Анализ с использованием 2 ⁴ Полный факторный дизайн

Значения выбранных независимых переменных, то есть времени гомогенизации (A), концентрации твердых липидов (B), жидких липидов (C) и концентрации поверхностно-активного вещества (D), и полученные результаты выбранных ответов, то есть PS, PDI , ZP и% EE показаны в таблице 2. Каждую независимую переменную и их взаимодействия оценивали статистически с помощью ANOVA. Полиномиальный коэффициент для каждой зависимой переменной был сгенерирован программой Design-Expert® для количественной оценки эффекта каждой независимой переменной, как показано в уравнениях. 3, 4, 5 и 6. Уравнения отражают только значимые факторы и их взаимодействие.

где A время гомогенизации (мин), B - концентрация твердого липида (мг), C - концентрация жидких липидов (мг), а D - концентрация поверхностно-активного вещества (мг). Положительные и отрицательные знаки перед каждым фактором или факторами взаимодействия в уравнениях представляют либо синергетический, либо антагонистический эффект, соответственно. Графики поверхности отклика были созданы, чтобы наблюдать одновременное влияние каждого фактора или взаимодействия факторов на параметры отклика.

Влияние переменных на средний размер частиц

Как показано в формуле. 3, факторы A , C , и D обладают антагонистическим действием на размер частиц (PS). Можно сделать вывод, что увеличение времени гомогенизации (коэффициент A ) одновременно со значительным снижением ПС НЖК ( p <0,05). Вероятно, это связано с высокой силой сдвига при гомогенизации, которая эффективно разбивает липидные глобулы на более мелкие частицы. Точно так же увеличение концентрации жидких липидов ( C ) одновременно снижает PS НЖК. Это может быть связано со способностью олеиновой кислоты снижать вязкость системы, а также поверхностное натяжение в сочетании с Compritol 888 ATO®, что приводит к уменьшению размера частиц НЖК. О способности жидкого липида снижать вязкость системы при объединении с твердым липидом также сообщили Jenning et al. при приготовлении дисперсии СЛН [5]. Авторы заметили, что увеличение концентрации жидких липидов от 0 до 38% в композиции липидной матрицы приведет к уменьшению размера частиц. Кроме того, увеличение концентрации поверхностно-активного вещества ( D ) снизит PS, потому что большее количество поверхностно-активного вещества, присутствующего в системе, будет легко эмульгировать общее содержание липидов в составе, таким образом, образуя более мелкие наночастицы.

На рис. 2 показан значительный ( p <0,05) влияние факторов (AC, BD и CD) на PS NLC. Положительное влияние фактора (BD) и отрицательное влияние факторов (взаимодействие AC и CD) показали значительное влияние на размер частиц НЖК. Отрицательное влияние фактора (AC) показало, что более длительное время гомогенизации и более высокая концентрация жидких липидов вызывает снижение PS. Взаимодействие между более высокими концентрациями твердого липида и поверхностно-активного вещества в составе NLC (взаимодействие BD) показало значительное положительное влияние на размер частиц, что привело к увеличению размера частиц. Напротив, взаимодействие между более высокими концентрациями жидкого липида и поверхностно-активного вещества (взаимодействие CD) показало значительное отрицательное влияние на размер частиц, когда был получен меньший размер.

График поверхности отклика, отображающий значимость ( p <0,05) влияние времени гомогенизации, концентрации жидких липидов, концентрации поверхностно-активного вещества и взаимодействия между a AC, b BD и c КД на ПС HVD-NLC. А время гомогенизации, B твердый липид, C жидкий липид, D поверхностно-активное вещество

Влияние переменных на PDI

Как показано в формуле. 4 показано, что олеиновая кислота оказывает отрицательное влияние на PDI, что означает, что увеличение концентрации олеиновой кислоты приведет к снижению значений PDI и приведет к лучшему распределению частиц NLC. Подобное влияние олеиновой кислоты на НЖК наблюдали и некоторые исследователи [6]. На рисунке 3 изображено взаимодействие между временем гомогенизации и концентрацией жидких липидов (AC-взаимодействие). Это взаимодействие показало значительный отрицательный эффект на PDI. Это означает, что более длительное время гомогенизации и более высокая концентрация жидких липидов приведет к снижению значений PDI. Кроме того, взаимодействие между концентрациями жидкого липида и поверхностно-активного вещества (взаимодействие CD) показало синергетический эффект на значения PDI. Таким образом, одновременное увеличение концентраций жидких липидов и поверхностно-активного вещества приведет к увеличению значений PDI и получению менее однородных частиц HVD-NLC. Это может быть связано с дальнейшим увеличением концентрации поверхностно-активного вещества сверх оптимизированного значения, что может вызвать накопление поверхностно-активного вещества на внешних поверхностях наночастиц, что, в свою очередь, увеличивает значения PDI. Та же картина наблюдалась и Shamma et al., Когда увеличение концентрации поверхностно-активного вещества вызывало увеличение значений PDI НЖК [7].

График поверхности отклика, отображающий значительную ( p <0,05) влияние концентрации жидких липидов и взаимодействия между a AC и b CD на PDI HVD-NLC. А время гомогенизации, C жидкий липид, D поверхностно-активное вещество

Влияние переменных на ZP

Составы HVD-NLC имели отрицательный заряд из-за ионизации глицерил бегената (жирная кислота в Compritol 888 ATO®), олеиновой кислоты и остатка сульфата декстрана. На основании уравнения. 5, увеличение количества олеиновой кислоты оказало негативное влияние на наночастицы и привело к увеличению отрицательного заряда наночастиц, следовательно, к увеличению ZP HVD-NLC. Возможно, это связано с чрезмерной ионизацией многочисленных карбоксильных групп в олеиновой кислоте (жидкий липид) [8]. Более того, глицерил бегенат (твердый липид) также показал отрицательное влияние на значения ZP, где увеличение его концентрации увеличивает ZP наночастиц. Это связано с более высокой ионизацией карбоксильных групп в глицерил бегенате, что приводит к более высоким отрицательным зарядам на внешней поверхности наночастиц.

Взаимодействие с BD оказало значительный положительный эффект на ZP NLC, в то время как взаимодействие с CD показало отрицательный эффект (рис. 4). Увеличение концентрации твердого липида и уменьшение концентрации поверхностно-активного вещества снижает отрицательный заряд наночастиц и снижает значения ZP. Вероятно, на этом этапе более низкая концентрация поверхностно-активного вещества не сможет ионизировать общее количество твердого липида, что приведет к уменьшению отрицательных зарядов на поверхности наночастиц, тем самым уменьшив ZP HVD-NLC. Кроме того, одновременное увеличение концентрации жидкого липида и поверхностно-активного вещества (взаимодействие CD) могло бы значительно увеличить значение ZP HVD-NLC. Это связано с тем, что больше карбоновой кислоты будет ионизировано в присутствии более высокой концентрации поверхностно-активного вещества в составе.

График поверхности отклика, отображающий значительную ( p <0,05) влияние концентрации жидких липидов, концентрации поверхностно-активного вещества и взаимодействия между a BD и b КД на ЗП HVD-NLC. Б твердый липид, C жидкий липид, D поверхностно-активное вещество

Влияние переменных на% EE

Уравнение 6 показывает, что увеличение времени гомогенизации значительно ( p <0,05) уменьшают% ЭЭ препарата. Более длительное время гомогенизации может привести к срезанию или отслаиванию молекул лекарства, прикрепленных к внешней поверхности наночастиц, что привело к снижению% EE лекарства в HVD-NLC. Напротив, увеличение концентрации поверхностно-активного вещества приводило к более высокому% EE лекарственного средства в HVD-NLC. Это может быть связано с тем, что более высокая концентрация поверхностно-активного вещества увеличит его внешнее поверхностное покрытие из НЖК, где часть лекарства будет захвачена им. Zhuang et al. и Das et al. предположили, что адекватная концентрация поверхностно-активного вещества необходима для солюбилизации молекул лекарства внутри липидной решетки и на внешней поверхности наночастиц [9, 10].

Как показано на рис. 5, взаимодействие AD имело значительную ( p <0,05) отрицательное воздействие, в результате чего увеличение времени гомогенизации и уменьшение количества поверхностно-активного вещества снижает% EE лекарства в HVD-NLC. Напротив, взаимодействие между концентрациями твердого липида и поверхностно-активного вещества (взаимодействие BD) показало положительный эффект на% EE лекарственного средства. Следовательно, увеличение концентрации твердого липида и поверхностно-активного вещества приведет к увеличению% EE лекарства в HVD-NLC. Вероятно, это связано с более высокой концентрацией поверхностно-активного вещества, которое солюбилизирует избыточные молекулы лекарственного средства, и в то же время большее количество твердых липидов в системе вмещает избыточные молекулы лекарственного средства, следовательно, увеличивает% EE лекарственного средства в HVD- НЖК.

График поверхности отклика, отображающий значительную ( p <0,05) влияние времени гомогенизации, концентрации жидких липидов, концентрации поверхностно-активного вещества и взаимодействия между a AD и b BD по ЭЭ верапамила при HVD-NLC. А время гомогенизации, B твердый липид, D поверхностно-активное вещество

Выбор оптимизированных HVD-NLC с использованием функции желательности

Составы HVD-NLC с кодовыми номерами ВЕР-9, ВЭР-11, ВЭР-13 и ВЭР-15 имели более высокие значения желательности 0,863, 0,852, 0,811 и 0,840 соответственно. Эти составы были выбраны для дальнейшего изучения, поскольку значения желательности были ближе к 1. Индивидуальная и комбинированная функция желательности всех ответов для выбранных составов изображена на рис. 6. Среднее значение PS, PDI, ZP и% EE для них. составы находились в диапазоне от 173,46 ± 0,757 до 190,3 ± 8,22, от 0,451 ± 0,033 до 0,501 ± 0,019, от -46,73 ± 1,13 до -49,16 ± 1,55 и от 93,95 ± 4,10 до 98,81 ± 1,01, соответственно.

Bar graph displaying the individual and combined desirability of several responses on selected HVD-NLCs formulations. а VER-9, b VER-11, c VER-13, and d VER-15

Lyophilization Study

Lyophilization is one of the commonly used methods in the pharmaceutical field to change aqueous formulation into the dried form to prolong the physical and chemical stability of the nanoparticle during storage [11, 12]. However, the lyophilization step produces various stresses to the sample during the process. So, the need of cryoprotectant is essential to avoid the stress condition and protect the sample. Among the screened cryoprotectants, trehalose was found to be the most suitable one for protecting the HVD-NLCs formulations from aggregation after the lyophilization process. The HVD-NLCs formulations protected with trehalose had the smallest particle size and lowest PDI (Table 3). Trehalose offers many advantages over other cryoprotectants including less chemical interactions and exhibit higher glass transition temperature which may help to prolong the stability of nanoparticles. Furthermore, trehalose has been demonstrated as an efficient cryoprotectant for freeze drying of Compritol 888 ATO® (Glyceryl behenate) in the lipid-based nanoparticles [13, 14]. Thus, in the present study, trehalose was selected as cryoprotectant for the HVD-NLCs formulations.

In the next study, different ratios of trehalose were used in the HVD-NLCs formulations after or during the homogenization process. Table 4 shows the effects of different ratios of trehalose added into the formulations after homogenization on PS, PDI, and %EE.

The mean PS was found in the nano size range, while PDI was < 1 in all ratios of lipids to trehalose used in the study. However, the %EE of verapamil was decreased significantly with increasing the ratio of trehalose to lipids. The %EE of lipid:trehalose at the ratio of 1:1 was significantly higher than the lipid:trehalose ratio of> 1:1. Increasing the amount of trehalose beyond the lipid trehalose ratio of 1:1 enhanced the removal of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex. This is possibly due to the interaction between trehalose and dextran at the outer surface of nanoparticles, which promotes the displacement of verapamil from the verapamil-dextran sulfate complex and hence, lowers the %EE of drug in the HVD-NLCs. The interaction between trehalose and dextran takes place due to the formation of sugar-salt complex (trehalose-dextran complex), in that the trehalose (sugar) competes with cationic verapamil and forms complex with polyanionic dextran [15]. Miller et al. measured the viscosity and glass transition temperature of trehalose with boric acid and proposed the formation of chemical complex between trehalose and borate ion (B(OH)₄ ^- ) [15]. Therefore, based on the obtained results, the lipid to trehalose ratios of 1:1 and 1:2 were selected for the next study of trehalose addition during homogenization. Table 5 shows that the results of PS, PDI, and %EE were significantly better when trehalose were added during homogenization. This could be due to better mixing of trehalose in the HVD-NLCs formulation by the homogenization process. It is evident from the data that there was no significant difference in the %EE of lipid:trehalose ratios of 1:1 and 1:2. Therefore, formulation VER-9 and VER-11 at lipid:trehalose ratio of 1:1 was selected for further studies.

In Vitro Release of HVD-NLCs

The release profile of verapamil solution from the selected HVD-NLCs formulations (VER-9 and VER-11) in SGF and SIF are shown in Fig. 7. The release profile of verapamil from the VER-9 and VER-11 formulations was significantly longer than verapamil solution in both SGF and SIF media. Verapamil was loaded as an ionic complex with dextran sulfate in the HVD-NLCs formulation. This could be the reason for the sustained release of verapamil from the HVD-NLCS. The formulations released about ~ 85% of verapamil after 48 h and the drug had a prolonged release profile up to 72 h. On the other hand, the verapamil solution released approximately 99% of verapamil within 4 h. The release profiles of the selected formulations VER-9 and VER-11 were found almost similar in SGF and SIF release media. However, the release of verapamil from VER-9 was found slightly better as compared to VER-11 in the SGF release medium. The percentage cumulative release of verapamil at 72 h from VER-9 (95.91 ± 1.40) was found significantly higher as compared to VER-11 (90.67 ± 1.16) in the SGF medium. Therefore, VER-9 was selected as a final formulation and proceeded for further investigations.

Cumulative percentage of verapamil released in a SIF (pH 6.8) and b SGF (pH 1.2) release media for 72 h

DSC Study

The DSC analysis of verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, physical mixture (including Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), lyophilized blank formulation (Placebo), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 8. Verapamil, dextran sulfate, Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, and trehalose had the melting peak at 144.96 °C, 220.41 °C, 72.46 °C, 50.80 °C, and 100.13 °C, respectively. The thermograms showed that there was no significant shift in the peaks of physical mixture, lyophilized blank formulation, and HVD-NLCs formulation (VER-9) when compared to the individual peak components such as Compritol 888 ATO®, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate. This indicated the physical compatibility between the components. The endothermic peak of verapamil at 144.96 °C was no longer seen in the thermogram of HVD-NLCs formulation (VER-9) (Fig. 8f), which could be due to verapamil that had changed to amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs matrix [16].

DSC thermograms of a Compritol 888 ATO, b Polomxamer 188, c verapamil HCl, d dextran sulfate, e trehalose, f verapamil HCl and dextran sulfate physical mixture, g physical mixture (including Compritol 888 ATO, poloxamer 188, trehalose, verapamil, and dextran sulfate), h placebo, and i HVD-NLCs formulation (VER-9)

WAXS Study

The WAXS/2θ scans of pure verapamil, dextran sulfate, bulk Compritol 888 ATO®, trehalose, lyophilized blank formulation (containing Compritol 888 ATO®, oleic acid, poloxamer 188, Tween 80®, trehalose, and dextran sulfate), and lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9) are shown in Fig. 9. The diffraction peaks of pure verapamil showed specific crystalline nature of the drug at 2θ scattered angles 14.42°, 16.67°, 17.07°, 18.07°, 18.82°, 20.22°, 23.77°, and 26.27° [17]. However, the WAXS/2θ scans of HVD-NLCs formulation (VER-9) showed that the peaks of verapamil diminished indicating a decrease in the crystallinity of the drug when incorporated in the lipids of HVD-NLCs. The scan also showed the predominant peaks at 2θ scattered angles 12.47°, 15.17°, 16.87°, 21.07°, and 23.82° which possibly attributed to the crystalline structure of Compritol 888 ATO® and trehalose because none of these peaks showed similarity with any of the pure verapamil peaks [10]. The results suggested that verapamil was in the amorphous form when incorporated in the HVD-NLCs formulation. The Compritol 888 ATO® revealed polymorphic crystalline transformation upon heating, whereby it changed to a more stable form, and showed reduced intensity peaks at 21.1° and 23.3° in the HVD-NLCs and blank formulations. The WAXS pattern of pure dextran sulfate indicated its amorphous form.

X-ray patterns of a lyophilized HVD-NLCs formulation (VER-9), b lyophilized blank formulation, c trehalose, d dextran sulfate, e verapamil HCl, and f Compritol 888 ATO

Electron Microscopic Examinations

The particle shape and size of the HVD-NLCs formulation (VER-9) were examined using the electron microscope. The liquid preparation of HVD-NLCs formulation (VER-9) observed under transmission electron microscope (TEM) showed that the particles had a spherical shape with the size less than 200 nm (Fig. 10). In contrast, observation under scanning electron microscope (SEM) revealed that the nanoparticles no longer had a spherical shape following lyophilization of the formulation without trehalose. However, the cryoprotective effect of trehalose could be seen when it was incorporated in the HVD-NLCs formulation (VER-9). The SEM image indicated that the trehalose helped to protect the structure of the nanoparticle to such extent when compared to the lyophilized formulation without the cryoprotectant (Fig. 11).

TEM image of VER-9 before lyophilization

SEM images of VER-9 formulation a without trehalose; б with trehalose

Cellular Uptake Study of HVD-NLCs

Caco-2 cells have been extensively used to study drugs intestinal cellular uptake [18]. The Caco-2 cells lines is spontaneously differentiating to form monolayer which has significant morphological and biological resemblance to the intestinal epithelium [19]. Several researchers have reported the in vitro cytotoxicity studies of Compritol ATO 888® [20], oleic acid [21, 22], Tween 80® [23, 24], and poloxamer 188 [25]. These substances were used as excipients in the optimized formulation of HVD-NLCs (VER-9). Based on their finding, these excipients were safe within the concentration used, the cell line type, and cell density that have been employed in the present study. The concentration of verapamil in the samples of VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex used in the cellular uptake study was in the range of 10.03 μg/200 μL to 30.1 μg/200 μL. It was found that the verapamil cellular uptake was increased with increasing the verapamil concentration in the samples. The cellular uptake values of verapamil from VER-9, verapamil solution, and verapamil-dextran complex were increased from 6.45 ± 2.62 to 15.92 ± 4.78 μg, 0.89 ± 0.28 to 1.46 ± 0.65 μg, and 0.064 ± 0.019 to 0.118 ± 0.003 μg, respectively (Fig. 12). The verapamil cellular uptake from the VER-9 formulation was 10.90- and 134.91-fold higher than the verapamil solution and verapamil-dextran complex, respectively. The results indicated that verapamil was passively transported from HVD-NLCs, verapamil solution, and verapamil-dextran complex in the caco2-cells. A similar finding of higher cellular uptake of drugs from a lipid-based nanoformulation was reported [26].

In vitro model of Caco-2 cell line showing cellular uptake of HVD-NLCs (VER-9), verapamil solution, and verapamil-dextran complex (mean ± SD, n =3)

Caco-2 cells act similarly as cell in animals when stimulated by fatty acid. van Greevenbroek et al. suggested that the incorporation of long-chain unsaturated fatty acids (e.g., oleic acid and linoleic acid) into the Caco-2 cells stimulate the secretion of very low-density lipoproteins (VLDL) and chylomicrons. In contrast, administration of saturated fatty acids primarily secretes intermediate- and low-density lipoproteins (IDL and LDL) [27]. Similar findings of increasing chylomicron secretion by the long-chain fatty acids were also reported by Caliph et al. in animal model [28]. In the present investigation, the long-chain fatty acids (Compritol 888 ATO® and oleic acid) used in the preparation of the HVD-NLCs may also stimulate the secretion of chylomicron, and hence increase the cellular uptake of the model drug.

Stability Study

The lyophilized VER-9 formulation was found stable for 6 months at refrigerated condition (5 ± 3 °C) (Table 6). There were no significant differences in the PS, PDI, ZP, and %EE after 6 months of stability study at storage temperature of 5 ± 3 °C. However, the VER-9 formulation was not stable after 1-month storage at the temperatures of 25 ± 2 °C/60 ± 5%RH and 40 ± 2 °C/75 ± 5% RH. The PS and PDI were increased significantly, while the total drug content decreased significantly. After 1 month of stability study, the samples were not measurable due to aggregation and sticky behavior of the nanoparticles.

Conclusion

The lyophilized HVD-NLCs formulation was successfully developed and optimized. The lipid carriers had prolonged the release of verapamil from the HVD-NLCs formulation. The formulation was in the nano size range and stable for 6 months at 5 ± 3 °C. The cellular uptake of verapamil lipid formulation (NLCs) was found higher than the non-lipid formulations. This suggested that the NLCs as a lipid carrier for verapamil may play an important role in improving the absorption of the drug.

Сокращения

%EE:

Percentage of entrapment efficiency

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagles medium

DSC:

Дифференциальная сканирующая калориметрия

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

HVD-NLCs:

Hybrid verapamil-dextran nanostructured lipid carriers

ICH:

The international council for harmonization of technical requirements for pharmaceuticals for human

IDL:

Intermediate density lipoproteins

LDL:

Low density lipoproteins

NLCs:

Nanostructured lipid carriers

PBS:

Phosphate-buffered saline

PDI:

Индекс полидисперсности

PS:

Particle size

RH:

Relative humidity

SEM:

Сканирующий электронный микроскоп

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

VLDL:

Very low-density lipoproteins

WAXS:

Wide-angle X-ray scattering

ZP:

Zeta potential