Выращивание наноструктур золота для избирательного поглощения клетками

Фон

Золотые наноструктуры (НС) использовались в различных биомедицинских приложениях благодаря своим оптическим и электронным свойствам, зависящим от формы и размера [1]. НС Au демонстрируют модифицируемый и экологически чувствительный локализованный поверхностный плазмонный резонанс (LSPR) [2]. Au LSPR в видимом диапазоне делает их подходящими кандидатами в качестве биосенсоров и хороших контрастных агентов для компьютерной томографии (КТ) [3, 4], а также для фотоакустической визуализации [5]. НЧ с еще более высоким соотношением сторон (АО, определяемое как отношение продольных к поперечным размерам) более эффективно рассеивают свет на длине волны продольного плазмона и, следовательно, могут работать лучше в приложениях оптической визуализации, чем сферические НЧ. НС меньшего размера обладают повышенной эффективностью абсорбции, что приводит к повышению эффективности фототермической терапии [6,7,8,9]. Кроме того, недавно были использованы анизотропные структуры для формирования самоорганизующихся структур с превосходными плазмонными свойствами, которые проистекают из эффективного тушения, чрезвычайно высоких молярных коэффициентов поглощения и развития сильно локализованных и интенсивных электромагнитных полей [10,11,12,13]. Имея возможность настраивать соотношение сторон и размер Au NS, можно синтезировать различные структуры для различных приложений, включая локализованный нагрев, зондирование, инкапсуляцию и высвобождение целевых молекул, среди прочего [14,15,16].

НЗ золота обычно синтезируют с помощью электротемплинга [17], техники фотохимического восстановления [18] или выращивания с помощью затравки - с Ag или без него [19, 20]. В последние годы синтез выращенного растения подвергся дальнейшим модификациям с использованием органических добавок или бинарных смесей поверхностно-активных веществ, позволяющих контролировать рост NS [21,22,23,24,25]. Используемые условия синтеза позволяют настраивать свойства НЗ Au, настраивая их размер и форму, тем самым изменяя сечения рассеяния и поглощения НЗ. Когда НП вводятся в биологическую среду, физико-химические свойства этих НП золота (размер, форма и химия поверхности) играют жизненно важную роль в клеточном поглощении, то есть во взаимодействии наночастиц с клеткой. Понимание такого взаимодействия необходимо для изучения новых биомедицинских приложений, использующих Au NS различной формы [26,27,28,29,30]. Например, наностержни Au можно использовать для индукции гипертермии в раковых клетках с возможностью вмешательства в клеточные функции и в некоторых случаях изменять их посредством модификации поверхности стержней [30,31,32,33,34]. Chen et al. сообщили, что наноклетки Au могут быть использованы для направленной фототермической деструкции клеток рака груди [35]. Кроме того, недавние отчеты показали, что форма наночастиц может быть в равной или большей степени определяющей для клеточного поглощения, чем размер [36, 37]. Это требует скрининга нескольких форм (т. Е. Взаимодействия Au NS различной формы с клеткой) в других идентичных условиях, важных для описания in vitro . Насколько нам известно, не существует комплексных исследований, посвященных взаимодействию НЗ золота различной формы, кроме сфер и наностержней, с ячейкой [38, 39].

Здесь мы исследуем взаимодействия пяти НП Au различной формы с клетками глиобластомы-астроцитомы и их клеточное поглощение. Мультиформная глиобластома (ГБМ) классифицируется как одна из самых агрессивных злокачественных опухолей головного мозга человека. Пациенты, страдающие ГБМ, имеют мрачный прогноз со средней продолжительностью жизни менее 15 месяцев при химиотерапии и стандартном лечении [40, 41]. Глиобластома-астроцитома особенно интересна для изучения не только с медицинской точки зрения, но и из-за их быстрого роста. Культуры клеток глиобластомы-астроцитомы имеют время удвоения популяции 32 часа и постоянно нуждаются во внеклеточных питательных веществах. Из-за этого они с большой вероятностью быстро захватят инородные объекты, такие как Au NS, которые открываются, например, для гипертермической абляции опухоли [42], мечения клеток или доставки лекарств.

В настоящей работе синтезированы пять различных форм НЗ Au:четыре анизотропных НЗ (наностержни –– НК, нано макура–– NM, тетрагексаэдры –– THH, бипирамиды –– BPs) методом семенно-опосредованного роста с использованием бинарных смесей поверхностно-активных веществ и сферических (SP) частиц с использованием модифицированного метода Туркевича [43]. Форму NS можно изменять, варьируя соотношение двух разных поверхностно-активных веществ. При соблюдении двухэтапного протокола роста, опосредованного семенами, Au nano makura ( Макура в переводе с японского означает подушка ) был синтезирован. Выполняли двухэтапную модификацию поверхности для замены пассивирующего лиганда на 11-меркаптоундекановую кислоту (MUA) перед совместной инкубацией НП Au с клетками глиобластомы-астроцитомы. Было оценено влияние формы и концентрации на цитотоксичность и поглощение NS клетками глиобластомы-астроцитомы.

Экспериментальный

Материалы

Олеиновая кислота (OA, 90%) была приобретена у Alfa Aesar. Нитрат серебра (AgNO ₃ ), дидецилдиметиламмоний бромид (DDAB, 98%), хлористоводородная кислота (HAuCl ₄ .3H ₂ O, 99,999%), D - (-) - изоаскорбиновая кислота (AsA, 98%), боргидрид натрия (NaBH _4, ≥ 96%), 11-меркаптоундекановая кислота (MUA, 98%) и O- [2- (3-меркаптопропиониламино) этил] -O-этилполиэтиленгликоль (PEG-SH) с молекулярной массой 5000 Да были приобретены у Sigma-Aldrich. . Бромид цетилтриметиламмония (CTAB, 99% +) был приобретен у Acros Organics, а дигидрат цитрата натрия (Na-цитрат, степень чистоты ACS) у Merck. Все химические вещества использовали в том виде, в котором они были получены, без дополнительной очистки. Все растворы были приготовлены с использованием дистиллированной деионизированной воды (удельное сопротивление ~ 18,2 мкОм-см), очищенной системой очистки воды Simplicity® Millipore.

Синтез анизотропного Au

Анизотропные НС Au были синтезированы с использованием метода посевного роста с использованием Ag с использованием бинарных поверхностно-активных веществ (Таблица 1). На рисунке 1а схематически показан метод синтеза, используемый для роста NR, THH и BP.

Схема синтеза НС Au. а Схема, показывающая механизм посевного роста с использованием Ag, используемый для синтеза различных форм Au NS. б Схема, показывающая двухсемянный механизм роста нано макура

Вкратце, 5 мл 0,5 мМ HAuCl ₄ .3H ₂ 0 сначала смешивали с 5 мл 0,2 М раствора CTAB и оставляли для перемешивания. После этого 1,6 мл 3,75 мМ NaBH ₄ добавляли к смеси и оставляли реагировать в течение 2 минут при перемешивании, чтобы позволить улетучиться газу, образующемуся во время реакции. Посевной раствор использовали для дальнейшего роста через 30 мин.

В типичной реакции роста 15 мл водной смеси CTAB и вспомогательного поверхностно-активного вещества в различных соотношениях были приготовлены при 80 ° C, как указано в таблице 1. После охлаждения раствора поверхностно-активного вещества до комнатной температуры 750 мкл 4 мМ раствора AgNO ₃ добавляли и давали перемешиваться в течение 15 минут при 35 ° C. За этим следовало добавление 15 мл 1 мМ HAuCl ₄ . .3H ₂ O и оставляют перемешиваться при перемешивании еще 15 мин. После этого добавляли 135 мкл 0,063 M AsA и 96 мкл затравки Au, и реакцию проводили в течение 24 ч при 35 ° C. Продукты разделяли центрифугированием. Важно отметить, что в случае ОА первоначальный желтый цвет ростового раствора исчезает в течение 15 минут (до добавления семян), что указывает на снижение содержания Au ³⁺ в Au ⁺ . На рис. 1b показана схема синтеза НМ, основанная на подходе двухзонного роста. Выполняемый протокол аналогичен описанному выше, за исключением добавления промежуточного раствора для выращивания (300 мкл) (полученного почти сразу после добавления семян Au к первому раствору для выращивания) вместо обычных семян к свежему раствору для выращивания и обеспечения реакции продолжать в течение 24 часов при 35 ° C.

Синтез сферических НС Au

Сферические НЗ Au были синтезированы по модифицированному методу Туркевича [44]. При обычном синтезе 10 мл 10 мМ раствора цитрата натрия добавляли в реакционную колбу на 25 мл, поддерживаемую при 70 ° C. Десять миллилитров 1,5 мМ хлористоводородной кислоты (HAuCl ₄ . 3H ₂ О) добавляли по каплям и давали возможность прореагировать в течение 20 мин при интенсивном перемешивании при 70 ° C. Раствор стал пурпурно-красным примерно через 8 мин после реакции. После этого раствор охлаждали до комнатной температуры, и сферические НС золота отделяли от непрореагировавшего раствора с помощью центрифугирования при 14 500 об / мин в течение 10 мин.

Функционализация поверхности Au NS

Для обмена лигандов на поверхности Au NS была адаптирована и модифицирована двухэтапная процедура Thierry et al. [45]. Концентрация синтезированных НП была доведена до 1 мг / мл ^-1 . до начала этапов функционализации. Первый шаг зависит от введения слоя PEG-SH для частичной замены связанного бислоя CTAB, поскольку тиол имеет большее сродство к поверхности Au [46]. Кроме того, слой PEG-SH обеспечивает стерическую стабилизацию NS. На втором этапе остаточный CTAB заменяется, а слой PEG-SH дополнительно заменяется алкантиолом, MUA. MUA позволяет полностью удалить CTAB со стерически затрудненной поверхности Au, покрытой PEG-SH.

В типичной процедуре функционализации 1 мл 1 мг / мл ^-1 раствор Au NS смешивали с 1 мл 1 мг / мл ^-1 раствор раствора ПЭГ-Ш. Смешанный раствор выдерживали при интенсивном перемешивании, позволяя частичную замену CTAB на PEG-SH в течение 2 часов. После этого ПЭГилированные НП удаляли центрифугированием при 14 500 об / мин в течение 20 мин и повторно диспергировали в 1 мл воды MQ. Для функционализации НП Au группами карбоновых кислот 500 мкл раствора ПЭГилированного НП смешивали с 250 мкл 10 мМ раствора MUA, приготовленного в смеси этанол / вода, и давали возможность прореагировать в звуковой бане, поддерживаемой при 55 ° C в течение 1 часа. . После этого Au NS, покрытые MUA, отделяли от свободных MUA с помощью центрифугирования при 14 500 об / мин в течение 20 мин. Au NS, покрытые MUA, легко повторно диспергировались в воде MQ.

Исследования in vitro

Культура клеток глиобластомы-астроцитомы

Клетки глиобластомы-астроцитомы человека (U-87 MG, ECACC, Sigma-Aldrich, Солсбери, Великобритания) культивировали в минимальной необходимой среде Игла (EMEM) с 1,25% гентамицином (Sigma) и 10% фетальной телячьей сывороткой (Autogen Bioclear, Wiltshire, СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО). В культуры добавляли 2 мМ L-глутамина, 1% заменимых аминокислот (NEAA, Sigma) и 1 мМ пирувата натрия (NaP, Sigma).

Анализ LIVE / DEAD®

Анализ жизнеспособности живых / мертвых клеток (Invitrogen, Life Technologies) оценивает целостность мембран клеток и состоит из двух разных красителей:кальцеина AM (возбуждение / испускание 494/517 нм) и гомодимера этидия-1 (возбуждение / испускание 517/617). нм). В живых клетках внутриклеточные эстеразы реагируют с кальцеином AM и дают цитоплазматическую зеленую флуоресценцию. Гомодимер этидия-1 (EthD-1) диффундирует через поврежденные клеточные мембраны мертвых клеток, где он связывается с нуклеиновыми кислотами и излучает красную флуоресценцию. После мечения NS оценивали жизнеспособность клеток LIVE / DEAD® на клетках глиобластомы-астроцитомы, как описано производителем. Вкратце, раствор LIVE / DEAD® готовили в 4,5 мл PBS с 2,7 мкл кальцеина (Invitrogen) и добавляли 12 мкл гомодимера этидия (Invitrogen) в соотношении 1:1 ( v / v ) соотношение и оставили реагировать в течение 30 мин при 37 ° C перед микроскопией. Добавляли краситель ядра (Hoechst 33258, возбуждение / испускание 356/465 нм, Sigma) (200 мкг мл ^-1 ), чтобы визуализировать ядро ​​и выяснить любое ядерное поглощение Au NS. Визуализацию проводили на флуоресцентном микроскопе Axiovert 200 M (Zeiss, Германия) при увеличении × 40 или × 10 с использованием AxioVision Rel. Программное обеспечение 4.3. Позже изображения были обработаны с помощью ImageJ 1.46.

Оценка клеточной токсичности на основе концентрации

Клетки с конфлюэнтностью 70% были помечены Au NS при концентрациях NS / объем среды 100 мкг / мл ^-1 , 200 мкг мл ^-1 , 500 мкг мл ^-1 , и 2 мг мл ^-1 и инкубировали при 37 ° C в течение 24 ч в 9-луночных планшетах (Corning®). Для каждой концентрации готовили по три параллели (лунки). Немеченые культуры глиобластомы-астроцитомы на той же стадии слияния использовали в качестве контроля. Процент мертвых клеток рассчитывали путем ручного подсчета. В высшей степени неупорядоченная морфология клеток глиобластомы-астроцитомы делает автоматизированный подсчет менее надежным. В каждую лунку делали по три наложенных изображения живых и мертвых клеток, и для каждой формы рассчитывали среднее количество живых и мертвых клеток. То же самое было сделано для холостого образца, а жизнеспособность оценивалась путем вычитания среднего количества мертвых / живых бланков.

Оценка клеточного поглощения как функции времени для нано макура Au NS

Клетки с конфлюэнтностью 70% были помечены нано makura Au NS при концентрациях NS / объем среды 2 мг / мл ^-1 и инкубировали при 37 ° C в течение 2, 6, 12 и 24 ч перед анализом LIVE / DEAD® с ядерным окрашиванием. Немеченые культуры глиобластомы-астроцитомы на той же стадии слияния использовали в качестве контроля. Осадки клеток готовили для ТЕА путем трипсинирования и центрифугирования перед первичной фиксацией в параформальдегиде (2% об. / v ) и глутаральдегид (2,5% об. / v ) в PBS (0,1 M, pH =7,4) в течение ночи. Для вторичной фиксации были приготовлены два разных фиксатора для оптимального окрашивания внутриклеточных мембран. Оба были приготовлены в 0,1 М какодилатном буфере, один из которых содержал 1% тетроксида осмия ( v / v ) и другой, содержащий 1% четырехокиси осмия ( v / v ) и 1,5% ферроцианида калия ( v / v ). Через час после вторичной фиксации при комнатной температуре была проведена ступенчатая дегидратация спиртом, перед дегидратацией пропиленоксидом, инфильтрацией и ультрамикротомным сечением срезов 70 нм.

Методы характеризации

Светлопольные (BF) STEM-изображения были получены с использованием электронного микроскопа Hitachi S-5500, работающего при ускоряющем напряжении 30 кВ. Изображения с помощью просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (HRTEM) получали с помощью JEOL 2100, работающего при 200 кВ. Распределение размеров и дзета-потенциалы NS измеряли с помощью прибора Malvern Zetasizer Nano-ZS и собственного программного обеспечения производителя. Измерения динамического рассеяния света (DLS) основаны на предположении о сферических частицах и не подходят для измерения гидродинамических размеров анизотропных НЗ без многоугловой установки и строгой подгонки полученных данных. Тем не менее, DLS использовалась в этом исследовании как средство для качественного отслеживания изменений в размере, происходящих в результате процедуры функционализации. Во всех случаях в качестве растворителя использовалась вода MQ. Спектры ультрафиолетовой и видимой (УФ-видимой) области были получены на спектрофотометре UV-2401PC (Shimadzu). Спектры получены в спектральном диапазоне от 200 до 800 нм. Анализы с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) проводили с использованием спектрометра Kratos Axis Ultra DLD (Kratos Analytical, Великобритания), снабженного монохроматизированным источником рентгеновского излучения из алюминия (Al, hν =1486,6 эВ), работающим при 10 мА и 15 кВ ( 150 Вт). Обзорные спектры получены в диапазоне энергий связи 0–1100 эВ при энергии прохода анализатора 160 эВ. Был использован режим гибридной линзы (электростатический и магнитный) вместе с площадью анализа приблизительно 300 мкм × 700 мкм.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика анизотропных НЗ золота

Анизотропные НП Au были синтезированы с помощью метода роста, опосредованного семенами, с использованием бинарных смесей поверхностно-активных веществ. Когда CTAB-покрытые затравки Au (~ 5 нм) добавляли к ростовому раствору бинарных смесей поверхностно-активных веществ (молярное соотношение OA CTAB ~ 20:1), образовывались Au NR с низким аспектным соотношением (рис. 2а и таблица 2). Изображение HRTEM показало монокристаллическую морфологию NR и морфологию собачьей кости (вставка на рис. 2a). ОА, жирная кислота, которая также действует как слабый восстанавливающий агент, способствует восстановлению Au ³⁺ в Au ⁺ . Изменение цвета ростового раствора от желтого до прозрачного (~ 15 мин) подтвердило наши наблюдения. Дальнейшее добавление аскорбиновой кислоты в ростовой раствор увеличивает скорость восстановления Au ⁺ . В результате атомы Au быстро диффундируют по торцевым {111} [16] граням NR, поскольку упаковка смешанных мицеллярных структур менее плотная по сравнению со стороной {110} и концом {100} NR [25]. Следовательно, чрезмерный рост NR на концах фасеток {111}, чем на боковых гранях {110} и {100}, приводит к образованию NR морфологии собачьей кости. Наши результаты также предполагают, что грани {110} вряд ли будут покрыты Au из-за сильного взаимодействия этих граней с молекулами поверхностно-активного вещества по сравнению с другими гранями. Мы также подтвердили роль ОА и аскорбиновой кислоты в формировании Au NR морфологии костей собаки. Когда концентрация ОА или аскорбиновой кислоты в ростовом растворе была уменьшена, были получены только Au NR. Эти результаты указывают на снижение скорости восстановления и скорости диффузии атомов золота, что приводит к образованию Au NR (дополнительный файл 1:рисунок S1, ESI †).

СТЭМ-изображения и УФ-видимые спектры Au NS различной формы. а BF-STEM изображение Au NR морфологии собачьей кости и изображение HRTEM на вставке показывает монокристаллическую природу NR. б BF-STEM-изображение вытянутых тетрагексаэдрических НЗ Au (вставка - SEM-изображение). c СЭМ-изображение ДП Au (вставка - СЭМ-изображение одиночного ДН). г ПЭМ-изображение сферических частиц золота (изображение ПЭМВР на вставке показывает поликристаллическую природу частиц золота). е BF-STEM изображение НМ Au. е УФ-видимые спектры НЗ Au различной формы

Когда концентрация OA относительно CTAB была увеличена в ростовом растворе (таблица 1), были получены NS Au удлиненной формы THH (фиг. 2b и таблица 2). Изменение формы НП Au можно объяснить на основе модификации смешанных мицеллярных структур с помощью ОА. Стержневидные структуры смешанных мицелл образуются при низкой концентрации ОА. Повышенное количество ОА в смешанных структурах мицелл изменяет их структуру на выпуклую и способствует образованию удлиненных НЗ THH Au. Наше предыдущее исследование также показало, что увеличение концентрации вспомогательного поверхностно-активного вещества делает смешанные мицеллярные структуры более выпуклыми [25]. Форму Au NS также можно изменить, заменив OA на DDAB. Мы получили НП Au бипирамидной (БП) формы с использованием CTAB и DDAB (рис. 2в и таблица 2), как сообщалось в нашей предыдущей работе [25]. Далее по модифицированному методу Туркевича были синтезированы сферические частицы Au (рис. 2г).

Мы также исследовали влияние затравочного раствора на форму НЗ золота. Затравочный раствор брали из ростового раствора CTAB и OA (OA:CTAB ~ 20:1) через 1 мин реакции и добавляли к свежему ростовому раствору, содержащему OA:CTAB ~ 20:1. Au NS нано макура (NM) морфология была получена после завершения реакции роста (рис. 2e). Морфология NM похожа на собачью кость. Однако, поскольку НЗ растут во всех направлениях, как показано на изображениях ПЭМ, сделанных под разными углами (Рис. 3a и Таблица 2), мы называем эти НЗ НМ. Чтобы проиллюстрировать механизм роста НМ Au, небольшой объем был взят из ростового раствора в различные промежутки времени, и промежуточная реакция была проанализирована с использованием изображений STEM (рис. 3b). Когда затравочные частицы, покрытые CTAB, добавляли к первому раствору для выращивания, цвет раствора для роста быстро становился темно-фиолетовым, что указывало на образование анизотропных NS Au. 300 мкл раствора из первого раствора для выращивания добавляли ко второму раствору для выращивания, а затем сразу несколько капель раствора добавляли в сетку ПЭМ.

Морфология и рост Au NM (nano makura ). а ПЭМ-изображения ЯМ под разными углами. б Изображения BF-STEM показывают стадии роста в формировании НЗ Au типа NM. Раствор, взятый из раствора для выращивания в разные моменты времени, был добавлен непосредственно в сетку ПЭМ без очистки

Репрезентативные изображения STEM показали относительно более быстрый рост Au NM в продольном направлении, чем в поперечном (0 с). Через 30 с были замечены НЗ, напоминающие конфигурацию бабочки. НМ, имеющие конечный размер, наблюдались уже примерно через 3 мин реакции. Мы не наблюдали дальнейшего изменения формы и размера НП через 30 мин и 8 ч. Основываясь на нашем анализе, можно предположить, что общий рост НМ Au следует за стохастическим автокаталитическим механизмом роста, похожим на «попкорн», при котором отдельные семена некоторое время находятся в состоянии покоя, прежде чем внезапно и быстро превратиться в окончательные формы, как это уже произошло. наблюдались для NR Cortie et al. [47]. НМ имеют трехмерную структуру, что показано на изображениях НМ, полученных методом ПЭМВР, полученных при разных углах поворота (рис. 3а), в отличие от ранее описанных НС в форме собачьей кости [48, 49].

Были измерены оптические свойства НЗ Au различной формы, результаты представлены на рис. 2е. Au NS отображают настраиваемые характеристики LSPR в УФ-видимом, видимом и ближнем инфракрасном (ИК) диапазонах. Полосы плазмонов расщепляются на мультиплеты для анизотропных структур - продольные и поперечные полосы из-за резонансных колебаний по разным осям. NR показывают по крайней мере три отдельные полосы –– 516 нм, 679 нм и 796 нм, самая сильная из которых - средняя. Появление третьей полосы может быть связано с полидисперсностью NR, вызванной травящим эффектом олеиновой кислоты. Это приводит к образованию наностержней с неровными краями. Как поперечные, так и продольные резонансные пики (557 и 760 нм соответственно) наблюдаются для НМ, которая имеет более неровную поверхность, чем наностержни. Однако для более крупных структур (THH и BP) одиночные и широкие пики LSPR наблюдаются при 568 нм и 593 нм соответственно. В то время как УФ-видимые спектры THH показывают сходное сходство с предыдущими исследованиями [50], две моды для BP кажутся слитыми в широкий пик, в отличие от наблюдаемого в других случаях [51]. Это может быть связано с низким выходом формы BP или неселективным центрифугированием формы, применяемым к Au NS, или неравномерным покрытием, приводящим к анизотропии формы в растворе.

Функционализация поверхности Au NS

Au NS различной формы функционализировали с использованием двухэтапного метода - замены двухслойного CTAB на O- [2- (3-меркаптопропиониламино) этил] -O-метилполиэтиленгликоль (PEG-SH), а затем на MUA. На рис. 4а показаны гидродинамические диаметры НС на каждом этапе функционализации. Последовательное увеличение размеров достигается по сравнению с NS, покрытыми CTAB, для каждого NS (кроме BP), что указывает на успешную функционализацию. Поскольку измерения DLS основаны на предположении о сферических частицах, анализ определения размера для анизотропных NS должен быть приближен к сферическим NS, имеющим те же коэффициенты диффузии, что и у анизотропных NS.

Размеры и дзета-потенциалы НЗ Au. а Варьирование размеров DLS Au NS после каждого этапа функционализации. б Изменение дзета-потенциалов Au NS на каждом этапе функционализации. X -ось представляет собой наноструктуру Au различной формы (наностержни NR, тетрагексаэдры THH, наноструктуры NM makura , БП бипирамида, СП сферическая)

Это проясняет небольшое уменьшение размера БП, покрытых PEG-SH, а также подтверждает данные УФ-видимого диапазона, приведенные выше. В результате функционализации поверхностные заряды НЗ значительно уменьшаются, как показано на рис. 4b. Катионное поверхностно-активное вещество легко замещается PEG-SH, который в дальнейшем заменяется MUA из-за более высокого сродства к поверхности Au. Благодаря небольшому размеру MUA, он обладает большей гибкостью для вытеснения CTAB, который остается на NS, даже после пегилирования. Конечные значения дзета-потенциала НП с покрытием из MUA отражают отрицательно заряженные поверхности для всех НП, кроме NR. Это несоответствие может быть связано с неравномерным покрытием малых NR или их полидисперсностью, а также с применяемым принципом измерения. Для сферических НЗ начальный отрицательный поверхностный заряд обусловлен цитратным покрытием. Однако высокие значения дзета-потенциалов для всех НС обеспечивают стабильность НС в водных растворах. Измерения XPS, проведенные на Au NS после каждой стадии функционализации, то есть с PEG-SH с последующим MUA, показывают очень низкое содержание брома на поверхности, подтверждая удаление связанного CTAB в больших количествах с поверхностей NS. (Таблица 1, ESI).

Кроме того, покрытие НС PEG-SH и MUA не меняет кардинально их оптические характеристики. Однако последовательное уширение пиков получается после функционализации для анизотропных НЗ (дополнительный файл 1:рисунок S3, ESI †). Это может быть из-за различных осей вращения НС из-за анизотропии, неоднородного покрытия, увеличения размера (данные DLS), полидисперсности образцов или комбинации вышеперечисленного. Поскольку оптические свойства НЗ золота зависят от формы, поверхности, размера и агрегатного состояния, то же самое зависит и от их взаимодействия с клетками. Исследования клеточного взаимодействия могут выявить степень захвата Au NS, их цитотоксические эффекты и указать на будущие терапевтические и диагностические применения.

Взаимодействие между клетками Au NS различной формы

Как правило, НП Au проникают в клетку посредством эндоцитоза, который может быть рецептор-опосредованным или рецепторнезависимым, через актин-зависимый фагоцитоз или другими неизвестными в настоящее время эндоцитозными путями [52]. Описание пути, по которому идет NS, имеет решающее значение, так как в конечном итоге определяет внутриклеточную судьбу NS [53]. Исследования показали, что механизм внутриклеточного поглощения зависит от физико-химических свойств, AR и характеристик поверхности NS, а также от типа клеток [54,55,56,57,58]. Заряд стабилизирующих поверхность молекул будет фактически зарядом НЗ [59]. Положительно заряженные НП обладают сильной адсорбцией белка в биологических средах и могут серьезно повредить мембраны клеток. В связи с этим предпочтительнее использовать нейтральный или отрицательный заряд, чтобы избежать сильной адсорбции на клеточных мембранах и / или адсорбции белка [26, 60]. Кроме того, форма NS будет определять, насколько равномерно покрытие поверхности стабилизирующими молекулами [61].

Здесь все НС Au, кроме НС сферической формы, были синтезированы с помощью поверхностно-активного агента ЦТАБ. Перед исследованиями взаимодействия клеток Au NS были функционализированы с помощью MUA для получения отрицательно заряженной поверхности. Стабильные покрытые MUA Au NS впоследствии были совместно инкубированы с клетками глиобластомы-астроцитомы человека в течение 24 часов, и влияние формы и концентрации на цитотоксичность было оценено с помощью анализа LIVE / DEAD®, дополненного ядерным красителем для выделения внутриклеточных Au NS. .

Наибольшая гибель клеток наблюдалась при высокой концентрации НМ (рис. 5а), при этом гибель клеток близка к 20% после коррекции холостого опыта. Другие NS не показали такой же тенденции цитотоксичности, что может указывать на то, что NMs поглощаются с большей скоростью / объемом, чем другие формы [62]. Подсчет клеток для этих форм показал цитотоксичность ниже 5% после пустой коррекции (для изображений всех форм см. Дополнительный файл 1:Рисунок S4, ESI †).

Влияние НП Au на клетки глиобластомы-астроцитомы. а Percentage cell death of glioblastoma-astrocytoma cells as a function of concentration of AuNSs. Incubation time was 24 h. Images b –m are acquired after incubation of makura -shaped AuNSs in glioblastoma-astrocytoma cells taken at several time points up to 24 h. б TEM shows an invagination of the cellular membrane (m membrane, scale bar = 1 μm), and c halogen and d fluorescence images show association of makura-shaped AuNSs at the cellular membrane. е Uptake of makura-shaped AuNSs were observed after 6 h (scale bar = 500 nm), f with uptake in intracellular vesicles (v vesicle, scale bar = 2 μm). г Staining of the nucleus (n ) suggests that makura-shaped Au NSs were excluded from the nucleus. ч TEM images taken after 12 h suggest uptake via macropinocytosis (scale bar = 500 nm), with i intravesicular location of makura-shaped AuNSs (vm vesicular membrane, scale bar = 500 nm). j Intracellular compartmentalization was also visible from the microscopy. Uptake of makura-shaped AuNSs continued at 24 h as seen in TEM images k (scale bar = 2 μm) and l (scale bar = 5 μm). m Detachment of glioblastoma-astrocytoma cells from the surface was observed, which most likely is an indication of cell death

The data presented here suggest that size plays a minor role in cytotoxicity in glioblastoma-astrocytoma cells. For instance, the small spherical NSs (15 nm) showed the same uptake/cytotoxicity as the large BPs (650/270 nm). Based on previous studies, we expected the NRs to give the highest cytotoxicity, due to their AR and surface charge. Positively charged NSs are considered to be particularly toxic as they can induce apoptosis [63] and cause the production of reactive oxygen species [64]. However, in the data presented here, the positively charged NRs did not show increased cell death compared to any other shape (Fig. 5a). This might be explained as follows:the surface charge of NS was determined with zeta potential measurements, an approach based on spherical particle assumption (Table 2). Thus, the reported charge of the NRs most likely misrepresents their actual charge. Although the AR of the rods synthesized here is large (2.8), their overall size falls in a size range that shows good uptake in cells (20–50 nm). [30, 65] A previous study has suggested that the size of NS does not only seem to govern endocytosis but also exocytosis. For instance, the removal half-life of 14 nm AuNS was much faster than removal half-life of 74 nm AuNS [26]. Here, the smaller Au rods and spheres, may, therefore, have been removed via exocytosis, which may explain their low cytotoxicity.

The main feature of the NM is not their size, but their irregular structure, and it appears from the image in Fig. 5a that shape has been the determining factor for the high uptake. However, an irregular morphology may have undermined the surface coverage of MUA and as such decreased the solution stability of the NM. Also, we cannot exclude that as two-dimensional cell studies are affected by gravity, a low stability in the cell medium increases the likelihood of sedimentation which can propel the endocytosis.

To get further insight into the uptake mechanism and interactions, we followed uptake of NM at high concentration (2 mg mL ⁻¹ ) with light microscopy and TEM for 24 h. The images show that after 2 h of co-incubation, the NM associate with the cellular membrane (Fig. 5c, d) and are engulfed by the cells (Fig. 5b, e). The mechanism of endocytosis seems to be initially receptor-mediated (Fig. 5b) and at later stages through macropinocytosis (Fig. 5h). The latter is believed to occur when large objects enter a cell, and the aggregation of NSs may have induced macropinocytosis. This might mean that the initial solution stability of the Au NM is sufficient, but that with time they aggregate and are taken up as larger species, most likely due to protein adsorption. Uptake of any extracellular NS in an intracellular vesicle involves wrapping of the cell membrane. If many such wrapping events occur, this alters the global elasticity of the cell membrane, which in turn affects the membrane integrity. If many macropinocytosis events occur, the membrane integrity may be severely impaired. This is believed to be one of the effects for the cytotoxicity observed for the NM.

Once inside the cell, it appears that the Au NM align at the periphery of the vesicles, adhering to the vesicular membrane (Fig. 5i). The endosome seems to be trafficked towards the nucleus (Fig. 5f, g, and l), which is consistent with previous studies that show that Au NSs taken up via receptor-mediated endocytosis may eventually end up in the Golgi apparatus [53, 66]. The uptake appears to continue upto 24 h (Fig. 5k), owing to the high concentration gradient of Au NS in the cell culture media [59].

At 24 h with co-incubation, the morphology of the cells changes (Fig. 5m), going from star-shaped to a more rounded shape with less visible filopodia [67], followed by detachment from the surface. Although this study does not go further in the molecular events following uptake of NS, a detachment of filopodia may suggest that NM can interact with the cytoskeleton and cause detachment and apoptosis.

We extended the cytotoxicity assay beyond 24 h and investigated the result of co-incubation at 48 and 72 h, the reason being that few cell studies are performed at these time points [68, 69], and the main argument being that cellular uptake reaches a plateau at 24 h [70]. Our results show (Additional file 1:Figure S5, ESI†) that beyond 24 h, the cells continued to detach from the flask surface, i.e., cell death and uptake continue beyond 24 h. As we cannot exclude that starvation of the cells would have increased the cytotoxicity and detachment, a cytotoxic response is a dynamic process likely to evolve over time differentially.

Выводы

In summary, we have synthesized five different shapes of Au NSs using a seed-mediated growth approach (nanorods, nanomakura , tetrahexahedral, bipyramidal) and the Turkevich method (spherical). These NSs have different sizes:the smallest being the NRs and the largest being the BPs, ranging from 22 to 156 nm. Their optical properties measured using UV-vis spectroscopy show LSPR span from UV, visible, to near IR. High values of zeta potential render good stability in aqueous solution. With an aim to exchange the cationic surfactant on the surface, a two-step functionalization protocol was employed to replace the CTAB with PEG thiol and MUA.

After coating, the NSs showed a decrease in surface charge, coupled with an increase in size, proving successful functionalization. In vitro studies were performed for all the synthesized NSs involving co-incubation with glioblastoma-astrocytoma cells for 24 h. The greatest cytotoxic response (~ 20%) was observed with NM at high concentration, which is consistent with higher uptake. An in––depth study with TEM revealed a time-dependent internalization in cancer cells via endocytosis and macropinocytosis. This successful internalization of the Au NM in cancer cells, coupled with their unique physicochemical properties, render them suitable for hyperthermia and drug delivery to cancer cells while being simultaneously imaged.

Сокращения

AgNO₃ :

Silver nitrate

Au:

Gold

BF:

Bright filed

BPs:

Bipyramids

CTAB:

Cetyltrimethylammonium bromide

DDAB:

Didecyldimethylammonium bromide

DLS:

Динамическое рассеяние света

EMEM:

Eagle’s Minimal Essential Medium

EthD-1:

Ethidium homodimer-1

GBM:

Glioblastoma multiforme

HAuCl4:

Cholorauric aicd

HRTEM:

Просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения

IR:

Инфракрасный

LSPR:

Локализованный поверхностный плазмонный резонанс

MUA:

11-Mercaptoundecanoic acid

Na-citrate:

Sodium citrate dihydrate

Нью-Мексико:

Nanomakura

NRs:

Nanorods

Ns:

Nanostructure

OA:

Oleic acid

PEG-SH:

O-[2-(3-Mercaptopropionylamino) ethyl]-O-ethylpolyethylene glycol

STEM:

Scanning transmission electron microscopy

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

THH:

Tetrahexahedra

УФ-видимый:

Ultraviolet-visible

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия