Стимуляция люминесценции квантовых точек CdSe / ZnS, покрытой цистеином, мезо-тетракис (п-сульфонатофенил) порфирином

Фон

Коллоидные полупроводниковые нанокристаллы или квантовые точки (КТ) благодаря своим специфическим характеристикам, интенсивному широкому спектру поглощения и узкому спектру люминесценции с зависящим от размера положением максимума и высокой термической и фотостабильностью [1, 2] находят применение в различных областях современной техники, таких как как медицинская визуализация и диагностика, современные вычислительные наноустройства, флуоресцентные зонды для биоаналитических приложений, фотоэлектрохимическое производство водорода и т. д. ([3,4,5,6,7] и ссылки в них). Функционализация поверхности КТ органическими молекулами позволяет повысить их растворимость в воде, снизить их токсичность и повысить их биосовместимость, получая КТ с селективным сродством к желаемым структурам живых организмов [8]. Поэтому КТ вызывают особый интерес для приложений в биологии [5] и медицине [6], где они могут быть успешно применены в качестве флуоресцентных зондов (ФП) для флуоресцентной диагностики (ФД) [9] и фотосенсибилизаторов (ФС) для фотохимиотерапии (ФХТ). [10]. Интенсивное поглощение в широкой спектральной области делает КТ эффективной антенной для накопления световой энергии, а интенсивная узкая полоса люминесценции способствует передаче энергии соответствующему ФС, тем самым повышая эффективность использования световой энергии и, как следствие, повышая эффективность ФС [7, 11] . Это делает пары (QD + PS) перспективными для применения в FD и PCT и стимулирует исследования взаимодействия QD и FS, особенно в области передачи энергии и заряда между ними.

Среди прочего, покрытые цистеином (CdSe / ZnS) QD ((CdSe / ZnS) -Cys QD) и мезо -тетракис (п-сульфонатофенил) порфирин (TPPS ₄ ) вызывают особый интерес по следующим причинам:небольшой размер покрытых цистеином КТ (QD-Cys), который увеличивает его подвижность и вероятность проникновения через клеточную мембрану, его высокая химическая стабильность, низкая неспецифическая адсорбция и высокий квантовый выход люминесценции [ 12, 13]. С другой стороны, синтетические TPPS ₄ порфирин является многообещающим ФС, поскольку он фотоактивен, водорастворим и нетоксичен и уже был протестирован в клиниках при применении в фотодинамической терапии (ФДТ), продемонстрировав обнадеживающие характеристики [14, 15].

Взаимодействие между TPPS ₄ и КТ через перенос энергии и / или заряда уже были описаны [16]. Обычно эти процессы сопровождаются уменьшением интенсивности люминесценции и времени жизни КТ. Еще один процесс, который вызывает самотушение люминесценции в КТ, - это самоагрегация за счет электростатических взаимодействий или образования водородных связей, во многих случаях делающих процесс агрегации обратимым [17].

В данной работе мы впервые сообщаем о стимуляции люминесценции КТ за счет взаимодействия с порфирином на примере (CdSe / ZnS) -Cys QD и TPPS ₄ порфирин.

Экспериментальный

Подготовка квантовых точек (CdSe / ZnS) -Cys

КТ (CdSe / ZnS) -Cys были синтезированы в соответствии с методом, адаптированным из [18]. Метод включает в себя следующее:(1) синтез коллоидных гидрофобных нанокристаллов ядра CdSe и (2) рост эпитаксиальной оболочки ZnS вокруг ядра CdSe. Чтобы функционализировать КТ цистеином, полученные КТ CdSe / ZnS ядро-оболочка (~ 3,0 мг) очищали от TOPO путем трехкратного диспергирования в хлороформе (500 мл) и осаждения метанолом (800 мл). Очищенные QD повторно диспергировали в хлороформе (1,0 мл). DL-цистеин в метаноле (30 мг / мл ^{- 1} , 200 мл) по каплям добавляли к дисперсии QD и интенсивно перемешивали с последующим центрифугированием (10000 об / мин, 5 мин), удаляя хлороформ. После промывания метанолом для удаления избытка DL-цистеина центрифугированием (16000 об / мин, 10 мин, 3 раза) осадок QD сушили в вакууме и повторно диспергировали в воде Milli-Q с 1 М NaOH (20 мл) по каплям. добавление и фильтрование шприцевым фильтром Anotop 25 Plus (0,02 мкм, Whatman).

Приготовление образцов порфирина + (CdSe / ZnS) -Cys QD

ТЭС ₄ порфирин был получен от Midcentury Chemicals (США) и использовался без дополнительной очистки. Экспериментальные растворы готовили в фосфатном буфере (pH 7,3; 7,5 мМ) с использованием воды качества Milli-Q. Для измерений люминесценции в КТ (CdSe / ZnS) -Cys, выдерживаемых при 276 К в течение 3 месяцев (КТ в возрасте), аликвоты концентрированного TPPS ₄ стандартный раствор ([TPPS ₄ ] _акции =140 мкМ) были добавлены к исходному раствору (CdSe / ZnS) -Cys QD, избегая эффектов разбавления. Для эксперимента по разведению старых КТ аликвоты исходного раствора заменяли таким же количеством фосфатного буфера. Все эксперименты проводились при комнатной температуре (297 К).

Концентрация TPPS ₄ контролировали спектрофотометрически с использованием ε _{515 нм} =1,3 × 10 ⁴ M ^{- 1} см ^{- 1} [19]. Концентрация состаренной квантовой точки (CdSe / ZnS) -Cys была рассчитана с использованием первого пика экситонного поглощения при 520 нм с использованием ε =5857 ( D ) ^2,65 согласно эмпирическому расчету Ю. [20], где D (нм) - диаметр данного нанокристалла. D значение было определено из эмпирической функции аппроксимации кривой, как представлено в [20]. Для нанокристаллов CdSe эта функция:

В нашем случае λ =520 нм, D =2,6 нм и ε =7,4 × 10 ⁴ M ^{- 1} см ^{- 1} .

Инструменты

Спектры поглощения контролировали на спектрофотометре Beckman Coulter DU640. Измерения стационарной люминесценции проводились на спектрофлуориметре Hitachi F-7000 при λ _бывший =480 нм и λ _em =558 нм. Квантовый выход люминесценции (QY) состаренных КТ определялся относительным методом [21] с измерением в одной точке, λ _бывший =480 нм и λ _em =558 нм, используя 1-пальмитоил, 2- (12- [N- (7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил) амино] додеканоил) -sn-глицеро-3-фосфохолин (C12 -NBD-PC) в качестве стандарта (QY =0,34 в этаноле) [22, 23] в соответствии с уравнением:

где I _fl и я _fl0 - интегральные интенсивности флуоресценции QD и C12-NBD-PC, A и A ₀ их оптическая плотность при λ _бывший =480 нм и n и н ₀ - показатели преломления используемых растворителей соответственно.

Эксперименты с временным разрешением проводились с использованием прибора, основанного на методе коррелированного по времени однофотонного счета. Источником возбуждения служил титан-сапфировый лазер Tsunami 3950 Spectra Physics, накачиваемый твердотельным лазером Millenia X Spectra Physics. Частота повторения лазерных импульсов составляла 8,0 МГц с использованием пикера импульсов 3980 Spectra Physics. Лазер был настроен так, что кристалл генератора второй гармоники BBO (GWN-23PL Spectra Physics) давал возбуждающие импульсы 480 нм, которые направлялись на Эдинбургский спектрометр FL900. Спектрометр имел конфигурацию L-формата, длина волны излучения выбиралась монохроматором, а испускаемые фотоны регистрировались охлаждаемым микроканальным пластинчатым фотоумножителем Hamamatsu R3809U. Полная ширина на полувысоте (FWHM) функции отклика прибора обычно составляла 100 пс, а временное разрешение составляло 12 пс на канал. Программное обеспечение, предоставленное Edinburgh Instruments, и коммерческое программное обеспечение OriginPro9 были использованы для построения экспериментальных кривых затухания люминесценции.

Качество подгонки оценивалось путем анализа статистического параметра уменьшенного - χ ² и путем проверки распределения остатков.

Динамическое рассеяние света измеряли с помощью анализатора размера частиц NanoBrook 90Plus Zeta при возбуждении на длине волны 640 нм с использованием гелий-неонового лазера мощностью 40 мВт (Brookhaven Instruments Corporation).

Результаты и обсуждение

Свежеприготовленные КТ (CdSe / ZnS) -Cys обладают максимумом спектра люминесценции при 558 нм (рис. 1, черная линия), как ранее сообщалось Liu et al. [13], а квантовый выход (QY) 0,75 [2, 24, 25]. Добавление TPPS ₄ к свежему раствору не вызывает изменений как в интенсивности люминесценции КТ, так и в профиле спектра люминесценции.

Нормализованные спектры люминесценции квантовых точек (CdSe / ZnS) -Cys 558 в фосфатном буфере (7,5 мМ) при pH 7,3:свежеприготовленные (черная линия, λ _макс =558 нм), после 3 месяцев в холодильнике при 276 К (состаренная КТ) без TPPS ₄ (красная линия, λ _макс =556 нм), а при добавлении [TPPS ₄ ] =5,0 мкМ для состаренных КТ (синяя линия, λ _макс =559 нм), λ _бывший =480 нм

Для (CdSe / ZnS) -Cys QD, растворенного в воде и выдержанного в холодильнике при 276 K в течение 3 месяцев (состаренная QD), положение максимума спектра люминесценции, измеренного в фосфатном буфере (7,5 мМ) при pH 7,3, был сдвинут в синий цвет на 2 нм ( λ _макс =556 нм) по сравнению со свежей КТ. Полоса излучения оказалась расширенной и слегка асимметричной (рис. 1, красная линия). Квантовый выход люминесценции состаренных КТ, определенный описанным выше методом, составил 0,23 ± 0,03.

Добавление TPPS ₄ к состаренному раствору КТ вызывает значительное увеличение интенсивности люминесценции (рис. 2а), значение QY достигает 0,75 ± 0,08 (рис. 2а, вставка), что близко к значению для свежих КТ [2, 24, 25].

а Спектры люминесценции и квантовый выход (вставка) состаренных растворов (CdSe / ZnS) -Cys 558 QD ([QD] =570 нМ, черная кривая) в зависимости от TPPS ₄ концентрация порфирина. б Кинетика затухания люминесценции КТ и соотношение \ ({I} _ {0_3} / \ left ({I} _ {0_2} + {I} _ {0_3} \ right) \) (вставка, см. Уравнение (3) ) как функция TPPS ₄ концентрация порфирина

Причем при наличии ТЭС ₄ наблюдалась симметризация полосы люминесценции состаренной КТ и уменьшение ее ширины с максимальным красным смещением до λ _макс =559 нм, что близко к максимуму спектра свежих квантовых точек (рис. 1, синяя линия).

Кривые затухания люминесценции, полученные при возбуждении 480 нм для растворов как свежих, так и состаренных КТ, были последовательно аппроксимированы как сумма трех экспонент:

где \ ({I} _ {0_i} \) и τ _я предэкспоненциальный множитель (амплитуда) и время жизни i -й компонент распада соответственно.

Время жизни компонентов как для свежих, так и для старых квантовых точек не зависит от присутствия порфирина (таблица 1). Времена жизни люминесценции свежих растворов КТ типичны для КТ (CdSe / ZnS) -Cys [26,27]. Для состаренных квантовых точек время жизни компонентов намного меньше (таблица 1).

Значения τ ₁ во всех случаях свежие и состаренные КТ в присутствии и в отсутствие порфирина близки к временному разрешению оборудования для однофотонного счета (≈ 100 пс), использованного в данном исследовании. Следовательно, он должен быть связан с рассеянным светом возбуждающего импульса.

Хорошо установлено [28,29,30], что короткоживущие ( τ ₂ ) и долгоживущие ( τ ₃ ) компоненты связаны с люминесценцией в результате аннигиляции электрон-дырка в ядре КТ ( τ ₂ ) и оболочка ( τ ₃ ), соответственно. Суммарная интенсивность этих двух компонент характеризует весь процесс аннигиляции в КТ. В этом случае относительная интенсивность (амплитуда) τ ₃ компонент должен демонстрировать вклад электронно-дырочной аннигиляции в оболочке КТ. Относительный вклад I ₃ 3-го компонента кривой затухания рассчитывалась как:

Добавление TPPS ₄ в свежих растворах КТ относительное содержание компонентов существенно не меняется (данные не показаны), в то время как для старых растворов КТ относительное содержание τ ₃ компонент I ₃ увеличивается с TPPS ₄ концентрации (рис. 2б, вставка). Зависимость QY люминесценции состаренных квантовых точек от TPPS ₄ концентрация аналогична концентрации для I ₃ (Рис. 2а, б, вставки), оба достигают максимальных значений примерно при 2,0 мкМ TPPS ₄ . Это означает, что TPPS ₄ взаимодействие с состаренной КТ сильнее влияет на люминесценцию оболочки КТ, чем ее ядра. Однако TPPS ₄ в свежих растворах КТ не оказывает влияния на люминесценцию КТ. Следовательно, делаем вывод, что TPPS ₄ Эффект, наблюдаемый для состаренного раствора КТ, не может быть объяснен связыванием порфирина с поверхностью КТ.

С другой стороны, наблюдаемое увеличение интенсивности люминесценции состаренных КТ при взаимодействии с TPPS ₄ не может быть объяснено обратной передачей энергии от ТЭС ₄ в QD, так как TPPS ₄ спектр флуоресценции локализован в диапазоне λ > 600 нм при слабом поглощении КТ (дополнительный файл 1:рисунок S3). Следовательно, передача энергии через механизм резонансной передачи энергии Ферстера (FRET) маловероятна. Причем люминесценция КТ возбуждалась на длине волны 460 или 480 нм, где TPPS ₄ оптическое поглощение незначительно. Кроме того, спектры поглощения TPPS ₄ остались неизменными в смешанных растворах, демонстрируя отсутствие переноса заряда между КТ и TPPS ₄ (Дополнительный файл 1:рис. S4b, c).

Способность квантовых точек агрегироваться посредством образования нековалентных водородных связей NH ··· H между поверхностными группами КТ уже была документально подтверждена [13,17]. Агрегация снижает люминесценцию КТ, наиболее эффективно тушая компонент, приписываемый оболочке КТ [13,17]. Для CdSe-QD в твердых пленках наблюдалось уменьшение интенсивности люминесценции и времени жизни КТ из-за образования 3D-агрегатов [31]. Авторы предложили модель, в которой это уменьшение связано с передачей энергии между отдельными квантовыми точками в совокупности [32].

На основании этих данных мы полагаем, что в холодильнике КТ действительно агрегируют, что снижает интенсивность и время жизни люминесценции. Таким образом, мы связываем наблюдаемое увеличение интенсивности люминесценции и времен жизни КТ в присутствии TPPS ₄ с дезагрегацией QD, стимулированной TPPS ₄ при его связывании с агрегатом. Аналогичный эффект наблюдался при испускании агрегированных КТ при их взаимодействии с ионами фтора [17].

Наблюдаемые изменения профиля полосы люминесценции состаренных КТ (рис. 1) можно объяснить агрегацией КТ, а ее асимметрия связана с существованием различных типов агрегатов. Взаимодействие с TPPS ₄ уменьшает агрегацию и делает профиль полосы люминесценции подобным профилю полосы неагрегированных КТ, наблюдаемому в свежих растворах.

При нейтральном pH поверхность QD-Cys обладает отрицательным суммарным зарядом из-за депротонирования концевых аминогрупп на ее поверхности [17, 33, 34]. При этом pH TPPS ₄ имеет чистый заряд (4-) из-за четырех отрицательно заряженных сульфонатфенильных групп в своей структуре ([35, 36] и ссылки в них). Следовательно, взаимодействие между цистеиновыми группами QD и TPPS ₄ молекул маловероятен из-за электростатического отталкивания. Однако высокое сродство π-сопряженной системы порфирина к металлическим поверхностям хорошо задокументировано [37]. Это сродство должно отвечать за TPPS ₄ связывание на поверхности квантовых точек, несмотря на электростатическое отталкивание между КТ и боковыми группами порфирина. Взаимодействие между поверхностью КТ и π-сопряженной системой связанного порфирина может объяснить слабое уширение спектра флуоресценции порфирина (рис. 1, 3 и дополнительный файл 1:рис. S3a, вставка) и наблюдаемые изменения в спектре возбуждения флуоресценции (дополнительные файл 1:Рисунок S5b, вставка) [38].

Нормированные спектры излучения люминесценции TPPS ₄ в фосфатном буфере (7,5 мМ, pH 7,3) для различных TPPS ₄ концентрации в присутствии состаренной квантовой точки (CdSe / ZnS) -Cys 558 (570 нМ), λ _бывший =460 нм

Связывание некоторых молекул порфирина на поверхности КТ увеличивает отрицательный заряд поверхности КТ, тем самым увеличивая электростатическое отталкивание между частицами и вызывая их дезагрегацию (Схема 1) [39].

Схема взаимодействия состаренных (CdSe / ZnS) -Cys 558 QD и TPPS ₄ порфирин при нейтральном pH. Молекулы порфирина адсорбируются на поверхности КТ из-за высокого сродства порфириновой π-сопряженной системы к металлическим поверхностям, увеличивая суммарный отрицательный заряд на поверхности КТ, тем самым увеличивая электростатическое отталкивание между частицами и вызывая их дезагрегацию

Площадь поверхности КТ A _QD ≈ 145 нм ² достаточно для адсорбции нескольких TPPS ₄ молекулы ( A _TPPS4 ≈ 1,8 нм ² на единицу) [40], как это наблюдалось для порфиринов, взаимодействующих с магнитными и золотыми наночастицами [41, 42].

Чтобы покрыть всю площадь КТ порфиринами, необходимо 80 молекул порфирина на индивидуальную КТ. Однако насыщенность свечения QY и I ₃ значения в растворе 570 нМ QD наблюдались примерно при [TPPS ₄ ] =2,0 мкМ (рис. 2), что демонстрирует, что связывания четырех молекул порфирина на одну КТ достаточно для дезагрегации КТ. Это можно объяснить большей плотностью заряда на молекуле порфирина по сравнению с плотностью заряда КТ (дополнительный файл 1:Рисунок S6), которая вызывает более сильное электростатическое отталкивание между КТ со связанными порфиринами. Действительно, дзета-потенциал для состаренной КТ (ζ _QD ) составляет - 36,1 мВ, а для TPPS ₄ молекула (ζ _TPPS4 ) составляет - 37,6 мВ. Средняя плотность заряда, рассчитанная как σ =ζ / A _QD , для человека в возрасте QD составляет

σ _QD =- 36,1 мВ / 145 нм ² =- 0,25 мВ / нм ² .

В то же время для отдельного пожилого QD, связанного с четырьмя TPPS ₄ молекул, средняя плотность заряда (σ _{QD + TPPS4} ) является

σ _{QD + TPPS4} =- (36,1 + 37,6 × 4) мВ / 145 нм ² =- 1,29 мВ / нм ² .

Таким образом, привязка четырех TPPS ₄ молекулы с индивидуальной состаренной КТ увеличивают свою σ более чем в 5 раз, увеличивая силу электростатического отталкивания более чем в 25 раз и вызывая дезагрегацию состаренных КТ.

В соответствии с гипотезой агрегации квантовых точек эффект, аналогичный эффекту TPPS ₄ добавление должно наблюдаться при разбавлении старых растворов КТ. Действительно, мы наблюдали увеличение КЯ люминесценции КТ при разбавлении ее буферного раствора (рис. 4а, вставка), что демонстрирует, что самотушение люминесценции КТ в состаренных растворах КТ-Cys зависит от концентрации КТ [17] . Одновременно I ₃ Значение кинетики люминесценции КТ также увеличивается с разбавлением (рис. 4б, вставка).

а Спектры люминесценции и квантовый выход (вставка) состаренных растворов КТ (CdSe / ZnS) -Cys 558 в зависимости от его концентрации. б Кинетика затухания люминесценции КТ и I ₃ значение (вставка, см. уравнение (3)) в зависимости от его концентрации

Более того, эксперименты по динамическому рассеянию света показывают, что D _hd Размер рассеиваемых частиц в растворах КТ после старения составил (330-170) нм, что намного больше, чем у свежих КТ. Разбавление снижает D _hd вплоть до (25 ± 6) нм, что напрямую демонстрирует дезагрегацию квантовых точек (дополнительный файл 1:таблица S1).

Есть еще один интересный аспект проблемы:может ли добавление TPPS ₄ к раствору свежих квантовых точек предотвращать их агрегацию при хранении при низкой температуре, тем самым стабилизируя их люминесцентные характеристики? Однако прояснение этой проблемы требует независимого и детального изучения с использованием различных экспериментальных методов и различных экспериментальных условий, таких как концентрации реагентов, температура, продолжительность хранения раствора (несколько месяцев) и т. Д. Мы планируем провести это глубокое исследование в ближайшее время. будущее.

Выводы

На основании полученных данных можно утверждать, что длительное хранение КТ CdSe / ZnS-Cys в водных растворах даже при низких температурах вызывает их агрегацию, что снижает квантовый выход и время жизни люминесценции. Добавление TPPS ₄ порфирин стимулирует дезагрегацию состаренных КТ CdSe / ZnS-Cys, что выражается в увеличении квантового выхода люминесценции КТ и вклада электронно-дырочной аннигиляции в оболочке КТ в общую люминесценцию КТ. Дезагрегация, стимулируемая порфирином, происходит за счет увеличения электростатического отталкивания между агрегированными квантовыми точками при их связывании с отрицательно заряженными молекулами порфирина. Дезагрегация наблюдалась и при разбавлении раствора QD.

Полученные результаты демонстрируют способ восстановления старых КТ путем добавления в растворы некоторых молекул или ионов, стимулирования дезагрегации КТ и восстановления их люминесцентных характеристик, что может быть важно для биомедицинских приложений КТ, таких как биоимиджинг и флуоресцентная диагностика. С другой стороны, дезагрегация важна для применения квантовых точек в биологии и медицине, поскольку она уменьшает размер частиц, облегчая их интернализацию в живые клетки через клеточную мембрану.

Сокращения

C12-NBD-PC:

1-пальмитоил, 2- (12- [N- (7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил) амино] додеканоил) -sn-глицеро-3-фосфохолин

FD:

Флуоресцентная диагностика

FP:

Флуоресцентные зонды

FWHM:

Полная ширина на половине максимальной

PCT:

Фотохимиотерапия

PDT:

Фотодинамическая терапия

PS:

Фотосенсибилизаторы

QD:

Квантовые точки

QD-Cys:

QD, покрытый цистеином

КГ:

Квантовые выходы

TOPO:

Оксид триоктилфосфина

TPPS _{4 4} :

мезо -тетракис (п-сульфонатофенил) порфирин