Реакция остеобластов на микропористые покрытия, легированные медью, на титане для улучшения интеграции костей

Введение

Материал имплантата из твердых тканей медицинского назначения должен иметь соответствующие механические свойства, такие как прочность, модуль упругости, износостойкость и сопротивление усталости, чтобы имплант мог выдерживать физиологическую нагрузку имплантированной области в течение длительного времени. В то же время материал должен обладать хорошей биосовместимостью и даже биоактивностью, чтобы имплант мог хорошо сочетаться с физиологической тканью области имплантации, не вызывая побочных реакций в организме человека. Чистый титан и титановые сплавы обладают хорошими механическими свойствами и биосовместимостью и в настоящее время являются наиболее широко используемыми материалами для металлических имплантатов.

После имплантации имплантата на поверхности материала сначала происходит серия биохимических реакций, и характеристики поверхности играют жизненно важную роль в реакции имплантата на внутреннюю среду. Микроструктура и химический состав поверхности имплантата могут изменять адсорбцию белков, а белки регулируют адгезию клеток и в конечном итоге определяют их функцию [1]. Хотя титан и титановые сплавы являются наиболее широко используемыми материалами для ортопедических имплантатов, титан не обладает биологической активностью. После имплантации в организм он не может образовывать химическую связь с костной тканью области имплантации. Титан и титановые сплавы в основном полагаются на механическое сцепление для достижения удержания [2] и не способствуют длительному физическому функционированию организма.

Покрытие поверхности титановых имплантатов может дополнить механические свойства титана и преодолеть его недостатки, связанные с низкой биологической активностью; то есть титан в качестве субстрата может обеспечивать механические свойства, а в качестве покрытия используются элементы с хорошей структурой поверхности и биологической активностью. Этот слой обеспечивает биологическую активность, и исследования в этой области стали горячей точкой для исследований.

В настоящее время технологии, используемые для получения биоактивных покрытий на металлических поверхностях, в основном включают плазменное напыление, осаждение с помощью ионного луча, электрофоретическое осаждение, импульсное лазерное физическое осаждение из паровой фазы, микродуговое окисление, осаждение с помощью магнетронного распыления, золь-гель, прямое лазерное наплавление и лазерная абляция [3,4,5,6,7,8,9,10]. Среди них коммерческое применение имеет технология плазменного напыления; однако существующая технология покрытия все еще не может соответствовать клиническим требованиям, в основном из-за следующих проблем:биоактивная фаза покрытия имеет низкую кристалличность и низкую биологическую активность; плохая прочность сцепления между покрытием и подложкой; внутренний материал покрытия легко растворяется, что сказывается на долговременной стабильности покрытия в организме; и процесс подготовки к покрытию слишком сложен, условия процесса жесткие, стоимость высока, а эффективность низка [11].

Микродуговое оксидирование, эффективная технология модификации поверхности, которая в настоящее время широко используется при модификации поверхности металлических имплантатов, использует эффект мгновенного спекания плазмы высокой температуры и высокого давления; не только поверхность материала образует шероховатую и пористую поверхность, но и биологически активные элементы также могут быть введены в покрытие. Поверхность материала, модифицированная с помощью технологии микродугового оксидирования, может значительно улучшить морфологию поверхности, шероховатость, гидрофобность и поверхностную энергию матричного материала, а также другие физические и химические свойства, так что биологическая активность и биосовместимость материала значительно улучшены. Остеоинтеграция между импортированным материалом и костной тканью имеет большое значение [12].

Медь (Cu) является важным микроэлементом в организме человека, который выполняет множество функций, в том числе способствует росту остеобластов и способствует экспрессии фактора роста эндотелия сосудов в тканях интимы, что способствует адгезии и пролиферации эндотелия сосудов. клетки. Cu также усиливает реакцию перекисного окисления липидов, ингибирует синтез бактериальной активной ДНК и родственных ферментов, которые мешают бактериальному энергетическому метаболизму, и нелегко приводит к устойчивости к лекарствам [13]; что еще более важно, ионы меди в определенном диапазоне концентраций признаны обладающими как высокой биологической активностью, так и превосходными антибактериальными свойствами. Таким образом, было доказано, что ионы меди обладают хорошей биосовместимостью при использовании в дизайне биоматериалов [14].

Взаимодействие между клетками и имплантатом является важным фактором, вызывающим образование интерфейса остеоинтеграции. Это взаимодействие в основном зависит от свойств материала поверхности имплантата, таких как химический состав поверхности, поверхностная энергия, поверхностный заряд и морфология поверхности. Это взаимодействие между клетками и имплантатами может влиять на адгезию, пролиферацию и дифференцировку клеток. Доказано, что пористая поверхность усиливает адгезию, пролиферацию и дифференциацию клеток, а имплантаты, допированные неорганическими ионами (цинк, стронций, магний и т. Д.), Также способствуют остеоинтеграции [15, 16].

Процесс микродугового оксидирования прост, а свойства готового покрытия можно регулировать. Покрытия, легированные разными ионами, можно получить, изменив состав электролита. Медь играет важную роль в организме. Соответствующее количество ионов меди в покрытии может способствовать размножению остеобластов и подавлять адгезию поверхностных бактерий. Поэтому в данной работе мы приготовили микропористый Cu – TiO ₂ покрытие на поверхности титана и использовалось в экспериментах на клетках in vitro и экспериментах на животных для наблюдения и анализа эффекта микропористого Cu – TiO ₂ покрытие на поверхностную активность и биосовместимость титана. Мы также стремились изучить возможность создания микропористого Cu – TiO ₂ покрытие в качестве нового типа материала для покрытия имплантата для усиления адгезии, пролиферации и остеогенной дифференцировки клеток MC3T3-E1 и содействия образованию и остеоинтеграции новой кости на границе имплант-кость, чтобы заложить теоретическую и экспериментальную основу для клинического применения микропористый Cu – TiO ₂ покрытие на поверхности титановых имплантатов.

Материалы и методы

Подготовка образцов и их характеристика

Путем проволочной резки титан был переработан в образец диаметром 12 мм и толщиной 1 мм. Имплантаты были изготовлены в виде титановых стержней диаметром 3 мм и длиной 8 мм. Наждачную бумагу разглаживали и промывали ацетоном и деионизированной водой для приготовления покрытия. В этом исследовании использовался самодельный маломощный источник питания для микродугового окисления; напряжение микродугового окисления составляло 450 В, режим был постоянным током, время микродугового окисления составляло 5 мин, а частота составляла 1000 Гц.

Контрольную контрольную группу обозначили Ti, а ацетат кальция и глицерофосфат кальция использовали в качестве основных растворов электролита. Образцы Ti после микродугового окисления в растворе основного электролита были помечены TCP, а образцы после микродугового окисления с различным содержанием оксида меди в растворе основного электролита были маркированы TCP Cu I и TCP Cu II (Таблица 1).>

Сканирующая электронная микроскопия с автоэмиссией (FE-SEM) использовалась для наблюдения за морфологией поверхности образцов, энергодисперсионная спектроскопия (EDS) использовалась для наблюдения за распределением элементов на поверхности покрытия, а профилировщик шероховатости использовался для оценки шероховатости разные образцы. Рентгеновская дифракция (XRD) и рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) были использованы для наблюдения за элементным составом и микроструктурой фазы покрытия и химическим состоянием.

Культура клеток

Клетки MC3T3-E1 (выделенные из клеток черепа мыши) использовали для клеточного тестирования in vitro. Клетки инкубировали в MEM с 10% фетальной бычьей сывороткой α при 37 ℃ в 5% CO ₂ . Когда клетки слились и выросли до 80% плотности, их переваривали и пассировали с 0,25% трипсином. Третий пассаж использовали для экспериментов на клетках.

Живое / мертвое окрашивание

Цитотоксичность каждой группы оценивали по окрашиванию живой / мертвой флуоресценции. Плотность посева клеток составляла 1,5 × 10 ⁴ . клеток / см ² . После 3 дней культивирования образцы промывали стерильным PBS и обрабатывали в соответствии с набором для определения жизнеспособности / цитотоксичности живых / мертвых животных. Цитотоксичность материала наблюдалась с помощью флуоресцентной микроскопии.

Адгезия и пролиферация клеток

Клетки высевали на поверхность каждой группы при плотности 1,5 × 10 ⁴ . клеток / см ² . После инкубации в течение 1 ч, 2 ч и 6 ч клетки промывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 мин. После промывки PBS 40 мкл окрашивающего агента DAPI было нанесено на поверхность образца в течение 10 минут, чтобы избежать светового окрашивания, и образцы наблюдались и отображались с помощью лазерного конфокального микроскопа.

Плотность посева клеток и метод культивирования были такими же, как указано выше, а активность пролиферации клеток измеряли с помощью набора CCK-8 через 1, 3 и 10 дней после культивирования клеток.

Экспрессия генов, связанных с остеогенной дифференцировкой

Плотность инокуляции клеток и метод культивирования были такими же, как указано выше. Клетки собирали через 1, 3 и 10 дней после инокуляции, и количественную ПЦР в реальном времени использовали для определения уровней мРНК генов, связанных с остеогенной дифференцировкой (включая BMP , COL-I, ALP и OCN ). Уровни экспрессии генов-мишеней были нормализованы к уровням гена домашнего хозяйства GAPDH . Наборы праймеров перечислены в таблице 2.

Животные и хирургия

Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Народной больницы провинции Гуйчжоу. Шестнадцать взрослых кроликов, самцов и самок, весом 3,6 кг (3,2–3,9 кг) были приобретены в Центре экспериментальных животных Университета Сучжоу и были разделены на экспериментальную группу и контрольную группу (по 8 кроликов каждая). Внутривенную анестезию проводили 3% пентобарбиталом натрия (0,1 мл на килограмм массы тела). После подготовки кожи ее фиксировали и регулярно дезинфицировали. На латеральном мыщелке бедренной кости был сделан продольный разрез для обнажения латерального мыщелка. С помощью хирургической электродрели просверливали отверстие диаметром 2,7 мм и глубиной 6 мм на плоской поверхности. Два набора титановых стержней были имплантированы в дефект кости (левый в экспериментальной группе и правый в контрольной группе), и пенициллин вводился в течение 3 дней подряд после операции для предотвращения инфекции.

Анализ микро-КТ

После операции кроликов содержали в отдельных клетках, и они могли свободно есть и пить воду. Через 4 и 8 недель после операции 8 кроликов были умерщвлены воздушной эмболизацией. Мыщелки бедренной кости кроликов, содержащие титановые стержни в экспериментальной и контрольной группах, были удалены, размер образца был обрезан, образцы были зафиксированы формалином, и сканирование микро-КТ использовалось для трехмерной реконструкции. Область интереса (ROI) была установлена ​​с помощью программного обеспечения Micro-CT, и была измерена объемная доля кости в интересующей области (объем кости / общий объем, BV / TV%).

Гистологическая оценка по окрашиванию толуидиновым синим и фуксин-метиленовым синим

Образцы обезвоживали градиентным спиртом (70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 100%). Дегидратированные образцы заливали метилметакрилатом. После успешной заделки образцы были вырезаны и обрезаны, закреплены на слайсере с помощью клея для резки и, наконец, отполированы наждачной бумагой до толщины среза примерно 20–30 мкм. (1) Окрашивание толуидиновым синим:краситель толуидиновый синий добавляли к поверхности среза, и срез окрашивали на водяной бане. Краситель поверхности сушили фильтровальной бумагой, промывали и сушили естественным путем на воздухе. Пленка герметизировалась и наблюдалась под световым микроскопом. (2) Окрашивание фуксин-метиленовым синим:метод был таким же, как при окрашивании толуидиновым синим. Сначала на поверхность срезов для окрашивания добавляли окрашивающий раствор метиленового синего, сушили на воздухе и ополаскивали. Затем срезы замачивали в окрашивающем растворе фуксина для окрашивания, сушили естественным путем на воздухе, запечатывали и наблюдали.

Статистический анализ

Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение, определенное программой SPSS 16.0. Для сравнения различий между группами использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA и тест SNK. P <0,05 указывает на значительную разницу.

Результаты

Морфология поверхности, фазовый и химический элементный состав образца

На рис. 1 показаны морфологии поверхности различных образцов, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа. Морфология группы Ti и других групп существенно различается. Группа Ti не имеет отверстий на поверхности, а поверхность относительно плоская, оставляя лишь некоторые царапины. Группа TCP имеет типичную морфологию поверхности микродугового окисления, при этом поверхность покрыта микропорами разного размера. Эти микропоры пересекаются друг с другом и имеют приблизительную «трехмерную структуру». Большие и маленькие поры вложены друг в друга, и поры не имеют фиксированных правил. Форма неправильная. Кроме того, в промежутках между отверстиями остаются прожоги. Подобно морфологии поверхности группы TCP, поверхности групп TCP Cu I и TCP Cu II также покрыты микропорами неправильной формы, и нет очевидной разницы в морфологии поверхности между группами. Легирование меди не влияет на структуру и морфологию микропор.

Морфология поверхности Ti, TCP, CP Cu I и TCP Cu II

На рис. 2 показано отображение и EDS-диаграмма микропористого Cu – TiO ₂ покрытие Как видно на диаграмме EDS, микропористый Cu – TiO ₂ покрытие состоит из Cu, Ti, Ca, P и O. Раствор, содержащий Cu, Ca и P, был полностью включен в покрытие. Что еще более важно, мы не обнаружили других токсичных и вредных элементов. Результаты картирования микропористого Cu – TiO ₂ Покрытие показывает, что медь, кальций и фосфор равномерно распределены в покрытии.

Картирование и диаграмма EDS Cu – TiO ₂ покрытие (TCP Cu II)

На рисунке 3 показаны рентгенограммы Ti, TCP, TCP Cu I и TCP Cu II. Все покрытия в основном состоят из титана, рутила и анатаза. Что еще более важно, CuO появился в микропористой Cu – TiO ₂ покрытие, которое указывало на то, что медь существует в форме CuO.

Диаграммы XRD для Ti, TCP, TCP CuI и TCP CuII

Рис. 4 представляет собой XPS-изображение микропористого Cu – TiO ₂ покрытие. На рис. 3а показан полный спектр микропористого Cu – TiO ₂ покрытие, определенное с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии, аналогично результату EDS, за исключением титана, кислорода, кальция и фосфора. Помимо характерных пиков меди, есть также характерные пики меди. Пик в Ti2 p спектр соответствует TiO ₂ , а пик Cu2 p при 932,7 эВ считается показателем CuO [17, 18].

XPS-изображение микропористого Cu-TiO ₂ покрытие. а Спектр XPS, b Ti2 p , c Cu2 p , d Ca2 p , e P2 p и е O1 s спектры

На рис. 5 показана морфология профилометра различных образцов. За исключением образцов Ti, морфология поверхности профилометра каждой группы схожа, что свидетельствует о вулканической многоступенчатой ​​структуре поровой полости. Дальнейший анализ шероховатости Ra каждой группы показал, что шероховатость TCP, TCP CuI и TCP CuII была больше, чем шероховатость Ti. Шероховатость TCP, TCP CuI и TCP CuII аналогична, и разница незначительна, что указывает на то, что микродуговое окисление увеличивает шероховатость Ti, но легирование меди не влияет на шероховатость образцов.

Морфология профилометра различных образцов

Адгезия и пролиферация клеток

На рис. 6а показаны изображения прикрепленных клеток через 1, 2 и 6 ч после окрашивания DAPI. На рис. 6b показано количество клеток MC3T3-E1, прилипших к поверхностям различных образцов в разное время. Количество прикрепленных клеток в разных группах образцов в разные моменты времени расположено в следующем порядке:TCP Cu II> TCP Cu I> TCP> Ti. По сравнению с группами Ti и TCP количество адгезивных клеток в группах TCP Cu I и TCP Cu II значительно увеличилось. Следовательно, микропористый Cu – TiO ₂ покрытие может значительно способствовать адгезии клеток.

Адгезия и пролиферация клеток MC3T3-E1 на поверхности различных образцов. а Изображения прикрепленных клеток через 1, 2 и 6 часов после окрашивания DAPI, b гистограмма прикрепленных ячеек и c гистограмма пролиферации клеток (данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, n =5. ** p <0,01 по сравнению с групповым TCP)

На рисунке 6c показано пролиферация клеток MC3T3-E1 на поверхности разных образцов в разное время. Подобно тенденции адгезии вышеупомянутых клеток, пролиферация клеток групп TCP Cu I и TCP Cu II была значительно выше, чем у групп Ti и TCP. Морфология поверхности микропористого Cu – TiO ₂ покрытие и ионы меди вместе способствовали пролиферации клеток.

На рисунке 7 показаны результаты окрашивания EdU. Соотношение EdU-положительных ядер соответствовало следующему порядку:TCP CuII> TCP CuI> TCP> Ti. По сравнению с группой Ti, пролиферация клеток в группе TCP CuII значительно различалась.

Окрашивание EdU измерено через 3 дня культивирования (данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, n =5. ** p <0,01 по сравнению с групповым TCP)

Живое / мертвое окрашивание

Цитосовместимость - основное требование к материалам имплантата. Живое / мертвое флуоресцентное окрашивание позволяет оценить цитотоксичность и биосовместимость материалов. На Фигуре 8 показаны результаты окрашивания живых / мертвых клеток после того, как клетки культивировали на поверхности различных образцов в течение 3 дней. На поверхности каждой группы образцов было всего несколько мертвых клеток (красные), что указывает на отсутствие очевидной цитотоксичности. Легирование меди в микропористые Cu – TiO ₂ покрытие явно не увеличивает цитотоксичность и хорошо совместимо с клетками.

Окрашивание живых / мертвых клеток на поверхности различных образцов (данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, n =5. ** p <0,01 по сравнению с групповым TCP)

Экспрессия генов остеогенной дифференцировки

На рисунке 9 показаны уровни экспрессии мРНК генов остеогенной дифференцировки ( BMP , OCN , ALP и COL-I ) на поверхности клеток каждой группы образцов в разные моменты времени. Со временем экспрессия генов остеогенной дифференцировки на поверхности каждой группы образцов постепенно увеличивалась. При этом экспрессия каждой группы генов имела следующую тенденцию:TCP Cu II> TCP Cu I> TCP> Ti. По сравнению с группами Ti и TCP, экспрессия генов дифференцировки, связанных с костями, состоящих из TCP Cu I и TCP Cu II, была значительно увеличена, что указывает на то, что микропористые Cu – TiO ₂ покрытие может способствовать остеогенной дифференциации.

Экспрессия мРНК BMP , OCN , ALP и COL-I через 1, 3 и 10 дней инкубации (данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, n =5. * p <0,05 по сравнению с групповым TCP, ** p <0,01 по сравнению с групповым TCP)

Общее наблюдение и анализ с помощью микро-КТ

На рисунке 10 показаны результаты макроскопического наблюдения и реконструкции мыщелка бедренной кости с помощью микро-КТ. Общее наблюдение показало, что имплантаты в двух группах находились в середине мыщелка бедренной кости на 4 и 8 неделях с хорошим расположением, без явной инфекции и без расшатывания имплантата. Трехмерная реконструкция с помощью микро-КТ показывает, что со временем новая костная ткань на поверхности двух групп образцов через 8 недель была больше, чем через 4 недели, а в разные моменты времени на поверхности образовалась новая костная ткань. микропористого Cu – TiO ₂ -покрытый титановый имплантат, и количество было больше, чем в контрольной группе. Сравнивая объемную долю кости в двух группах, объемную долю кости (BV / TV) микропористого Cu – TiO ₂ титана с покрытием был значительно выше, чем у контрольной группы. Микропористый Cu – TiO ₂ с титановым покрытием может способствовать остеоинтеграции титановых имплантатов.

Общее наблюдение и реконструкция мыщелка бедренной кости с помощью микро-КТ наблюдались через 4 и 8 недель после имплантации

Гистологическая оценка

На Фигуре 11 показаны результаты окрашивания толуидиновым синим и фуксин-метиленовым синим. На границе раздела кость-имплантат волоконной оболочки не наблюдалось, что указывает на то, что у титанового имплантата не было воспалительной реакции на границе раздела с костью. Белые промежутки можно увидеть в промежутках между титановым имплантатом и костью в двух группах. Ширина белых промежутков в контрольной группе была больше, чем у микропористых Cu – TiO ₂ покрытый титаном. Чем шире зазор, тем слабее индукция новой костной ткани имплантатами. Окрашивание толуидиновым синим показывает синюю полосу в промежутке между имплантатом и костью, которая является новой костью. Микропористый Cu – TiO ₂ в титане с покрытием было больше костной ткани, чем в контрольной группе, что указывает на то, что микропористые Cu – TiO ₂ покрытие может лучше способствовать остеогенезу и иметь лучший эффект остеоинтеграции. Костный матрикс вокруг микропористого Cu – TiO ₂ покрытый титаном был более толстым и непрерывным, а костная ткань значительно увеличилась. Напротив, в контрольной группе было меньше кости. Этот результат показывает, что микропористые Cu – TiO ₂ титан с покрытием может лучше способствовать остеогенезу и иметь лучший эффект остеоинтеграции.

Окрашивание новых костных образований толуидиновым синим и фуксин-метиленовым синим через 4 и 8 недель после имплантации

Обсуждение

Металлический титан и его сплавы широко используются в стоматологии, пластической хирургии и других областях благодаря своим превосходным механическим свойствам и биосовместимости; однако титан в качестве имплантата может только пассивно соединяться с костной тканью. Эта комбинация часто представляет собой механическую комбинацию, которая склонна к расшатыванию и опусканию имплантата, что приводит к его поломке. В настоящее время метод модификации поверхности имплантата в основном используется для улучшения его остеоинтеграционной способности [19]. Поверхность идеального имплантата должна обладать как остеокондуктивностью, так и остеоиндуктивностью, хорошей биосовместимостью и способствовать образованию остеоинтеграции между имплантатом и костной тканью [20]. В этом исследовании мы приготовили инновационный микропористый Cu – TiO ₂ покрытие на поверхности титана в надежде улучшить биологическую активность и биосовместимость титана и преодолеть недостатки титановых имплантатов в текущих клинических применениях.

Доказано, что ион меди и диоксид титана обладают хорошей биологической активностью [21]. В данном исследовании микропористый Cu – TiO ₂ Покрытие, полученное микродуговым окислением на поверхности титана, показало наибольшее преимущество прочного соединения между покрытием и титановой подложкой, что подтверждено в литературе [22]. Хорошая сила сцепления покрытия микродугового оксидирования тесно связана с процессом формирования. В процессе микродугового окисления сосуществуют химическое окисление, электрохимическое окисление и плазменное окисление. Под действием мгновенной высокой температуры и высокого давления, создаваемого дуговым разрядом, поверхность титана растет на поверхности подложки в виде «роста», в основном из оксида подложки. Керамическое покрытие, покрытие и подложка клыков расположены в шахматном порядке, и они обладают хорошей силой сцепления [23].

Характеристики поверхности биологических материалов напрямую влияют на биологические характеристики материалов. Покрытие микродугового оксидирования представляет собой шероховатую и пористую морфологию поверхности под электронным микроскопом. Морфология в основном состоит из микропор разного размера, которые проникают друг в друга. Эти небольшие поры образуются в процессе микродугового окисления, поверхность металла разрушается под высоким напряжением, и мгновенное высокотемпературное спекание в зоне микродуги непосредственно окисляет и спекает титановую матрицу в керамическую пленку со структурой кристаллической керамической фазы. , где происходит электрический пробой. Образуются микропоры, наблюдаемые под электронным микроскопом. These rough and porous structures can not only increase the attachment area of tissue cells, but these interpenetrating micropores are also equivalent to a three-dimensional scaffold structure, which can induce bone tissue to grow into the pores and promote cell adhesion and extension. Pan et al. [24] prepared micro/nanohierarchical structured TiO₂ coatings on polished titanium by micro-arc oxidation and found that the coatings were favorable for the adhesion and extension of MG63 cells. Zhang et al. [25] prepared a Si–TiO₂ coating by micro-arc oxidation, and further study showed that the adhesion of MC3T3-E1 cells on this silicon-containing TiO₂ coating was significantly higher than that on a Si-free TiO₂ coating and pure Ti.

The greatest advantage of the microarc oxidation coating is that the ions in the electrolyte solution can be introduced into the coating during the microarc oxidation process. In this study, the EDS analysis results of the coating surface showed that the microporous Cu–TiO₂ coating is mainly composed of Cu, Ca, P, O and Ti elements, of which titanium comes from the matrix, calcium and phosphorus come from the basic electrolyte solution, and the copper ions in the electrolyte are deposited in the coating along with the formation of the ceramic film. The calcium and phosphorus components on the surface of the implant can not only improve the surface properties of the material but also induce bone formation. In addition to calcium and phosphorus, the copper ions in the microporous Cu–TiO₂ coating have good biocompatibility and biological activity. Copper-doped coatings on the surface of implants have also been reported in the literature. Astasov-Frauenhoffer et al. [26] deposited copper on Ti via a spark-assisted anodization method and confirmed that the viability of the bacterial cells was strongly inhibited. Zong et al. [27] combined anodization and magnetron sputtering to combine copper into TiO₂ nanotubes and prepare copper (Cu) into TiO₂ NTAs (Cu–Ti–O NTAs), and further study showed that Cu–Ti–O NTAs have excellent long-term antibacterial ability and favorable angiogenic activity.

Biocompatibility is the minimum requirement for measuring implants and is also the basic guarantee for implant safety. In this study, biologically active copper was introduced into the surface of titanium implants through microarc oxidation; however, copper ions, as heavy metal ions, have potential toxicity. Therefore, we must consider whether the microporous Cu–TiO₂ coating is cytotoxic. In this study, live/dead cell staining was used to evaluate the microporous Cu–TiO₂ coating. The results showed no obvious cytotoxicity on the surface of the microporous Cu–TiO₂ coating on the titanium surface, and good cell compatibility was observed. We speculate that this finding may be related to the low copper content of the coating. Huang et al. [28] fabricated gap-bridging chitosan–gelatin nanocomposite coatings incorporated with different amounts of copper (Cu; 0.01, 0.1, 1, and 10 mM for Cu I, II, III, and IV groups, respectively) on Ti and demonstrated that the activities of bone marrow stromal cells were not impaired on Cu-doped coatings except for the Cu IV group.

Cell adhesion and proliferation are the basis of implant osseointegration in the later stage. The more cells that adhere and proliferate on the surface of the implant, the better the effect of implant-bone interface osseointegration. The results of this study showed that on the first day after the material surface was inoculated, the amount of cell adhesion on the surface of the samples of each group differed, and the amount of adhesion on the surface of the microporous Cu–TiO₂ coating group increased significantly. The number of cells that adhered to the sample surface gradually increased, but the number of cells that adhered to the group with microporous Cu–TiO₂ coating was significantly greater than that of the other two groups. The difference was statistically significant, indicating that the microporous Cu–TiO₂ coating was doped with copper ions. A porous, rough surface is most conducive to cell adhesion. Similar to cell adhesion, cell proliferation on the surface of each group of materials also showed similar results. Our research results are similar to previous reports [29].

In addition to adhesion and proliferation, the degree of cell differentiation on the surface of the material can further reflect the performance of the implant's osseointegration. The osteogenic differentiation marker genes ALP , BMP , RUNX2 , OCN and COL-I can reflect cell differentiation. In this study, as time went by, the expression of BMP, OCN, ALP and COL-I on the surface of each group of samples increased, but the expression of the microporous Cu–TiO₂ coating group was significantly higher than that of the control group. This finding is closely related to the promotion of osteogenic differentiation by copper ions. Komarova et al. [30] prepared Zn- and Cu-containing CaP-based coatings by microarc oxidation on Ti and showed that low amounts of Cu and Zn in the coatings promoted high motility of human adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells and subsequent ability to differentiate into osteoblasts.

Osseointegration is the key to the success or failure of the implant. This means that there is no fibrous tissue between the implant and the bone tissue. There is direct contact between the implant and the bone tissue, and it can directly bear stress to realize the relationship between the implant and the bone tissue, establishing a functional connection. The osseointegration between orthopedic implants and bone tissue is affected by many factors, such as the initial stability of the implant and the mechanical properties of the implant material, implant surface properties, biocompatibility, biological activity and the condition of the surrounding bone tissue [31].

An ideal implant position and a stable biomechanical environment are the prerequisite and basis for the osseointegration of the implant-bone interface. In this study, the femoral condyle was chosen to be implanted with a copper-doped microporous coating because the abundant blood supply and sufficient bone volume at the femoral condyle can provide a good anatomical basis and a relatively stable mechanical environment for the implant. Moreover, the femoral condyle is mostly cancellous bone. After implantation, bone formation and the effect of implant-bone interface osseointegration can be more intuitively evaluated.

Micro-CT is currently a common method for observing the osteogenesis performance of implants and is also an effective method for evaluating the osseointegration between implants and bone tissue. Bone microstructure is visualized through three-dimensional reconstruction and the region of interest (ROI) analysis with the assistance of related software to obtain the relevant parameters of new bone tissue. Among all the parameters, BV/TV represents the total amount of bone formation and is an important indicator reflecting the osseointegration of the implant. In this study, we chose BV/TV as the detection index. Four weeks after implantation, the BV/TV of the microporous Cu–TiO₂ coating group was higher than that of the control group. Eight weeks after implantation, the BV/TV values of the microporous Cu–TiO₂ coating group and the control group were higher than those at 4 weeks, and the BV/TV of the microporous Cu–TiO₂ coating group was higher than that of the control group. On the basis of micro-CT detection, we performed histological observation and quantitative analysis of the bone tissue around the implant through hard tissue slices. The results of VG staining showed that the microporous Cu–TiO₂ coating group formed more new bone than the control group, and the new bone that formed around it was in direct contact with the internal implant without fibrous tissue infiltration. These results indicate that microporous Cu–TiO₂ coating on the titanium surface can promote the osseointegration of titanium implants. This finding is similar to previous in vitro studies. The rough, porous structure produced by microarc oxidation mimics the micro/nanostructure of normal bone tissue. More importantly, biologically active copper ions promote bone tissue regeneration. Under the action of these common factors, bone tissue regeneration on the surface of the implant is promoted. Our research results are consistent with literature reports. Milan et al. [32] designed a multifunctional Cu/a-C:H thin coating deposited on Ti–6Al–4 V alloy (TC4) via magnetron sputtering and found that the coating composition can stimulate angiogenesis and osteogenesis and control the host response, thereby increasing the success rate of implants.

Conclusion

In summary, we prepared a microporous Cu–TiO₂ coating on a titanium surface by microarc oxidation. The surface of the coating has a porous structure with pores of different sizes and interconnected pores. The coating increases the surface roughness of Ti and copper is evenly distributed on the surface of the coating. In vitro studies revealed that the coating has no obvious cytotoxicity and can promote the adhesion, proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. In vivo experiments further confirmed that the coating can induce the formation of new bone tissue and promote osseointegration at the titanium implant-bone interface. In view of the biological activity in vivo and in vitro, we believe that the microporous Cu–TiO₂ coating on the surface of titanium implants has potential clinical application value in orthopedics.

Доступность данных и материалов

Not applicable.

Сокращения

MAO:

micro-arc oxidation

Cu:

copper

Zn:

zinc

Cu–TiO₂ coating:

copper–titanium dioxide coating

ROI:

region of interest

ALP:

alkaline phosphatase