Гиперспектральное мультиплексирование биологического изображения нанозондов, излучающих в коротковолновой инфракрасной области

Введение

Технологии биомедицинской визуализации стремительно развиваются в последние десятилетия, что позволяет раннее обнаруживать и оценивать различные заболевания и патологии. Среди различных методов визуализации оптическая визуализация занимает уникальное положение благодаря высокому пространственному и временному разрешению и относительно низкой стоимости. Множественные подходы к оптической визуализации, основанные на фотолюминесценции (или, более конкретно, флуоресценции), находятся в стадии разработки и клинически претворяются в жизнь. Например, визуализация лимфатической системы и хирургия под контролем интраоперационной флуоресцентной визуализации показали многообещающие результаты для развития здравоохранения [1, 2]. С другой стороны, экзогенные фотолюминесцентные зонды, нацеленные на конкретные интересующие области (например, опухоль), активно разрабатываются для визуализации in vivo и ex vivo. В дополнение к обычным требованиям к датчикам фотолюминесценции (например, высокое поглощение, квантовый выход излучения и фотостабильность), спектральное положение и форма излучения PL также являются важными параметрами, которые необходимо учитывать. Поскольку известно, что ослабление света биологическими тканями в ближнем инфракрасном (NIR) диапазоне спектра (~ 700–950 нм) ниже, чем в видимом, наличие окна прозрачности для биологических тканей в ближнем инфракрасном диапазоне (~ 700–950 нм) 950 нм), и много усилий направлено на разработку и применение зондов, излучающих БИК [3,4,5,6]. Более того, недавние достижения привели к появлению второго и третьего окон NIR (NIR-II и NIR-III) в спектральном диапазоне ~ 1000-1700 нм, который часто называют коротковолновым инфракрасным (SWIR), особенно производители в быстро развивающейся области инфракрасного изображения [7,8,9]. Несмотря на более высокое водопоглощение в диапазоне SWIR по сравнению с обычным окном NIR, более низкая автофлуоресценция и рассеяние биологических тканей обеспечивают превосходное разрешение изображения и большую глубину изображения в биовизуализации SWIR PL [10,11,12]. Например, при визуализации лимфатической и мозговой сосудистой сети SWIR PL с использованием нового флуоресцентного красителя SWIR CH1055-PEG было показано, что разрешение и соотношение сигнал / фон превосходят по сравнению с традиционной визуализацией NIR PL с флуоресцентным красителем NIR-I, индоцианиновым зеленым. [13]. Более того, использование нанозондов, излучающих SWIR (однослойные углеродные нанотрубки) и камеры для визуализации SWIR, позволило группе Дая визуализировать сосуды размером менее 10 мкм на глубине> 2 мм при неинвазивной (без краниотомии) визуализации сосудов головного мозга мышей. который недоступен для визуализации ФЛ в видимом или ближнем ИК-диапазоне [8].

Органические красители и комплексы красителей с интенсивным поглощением в первом окне ближнего инфракрасного диапазона и флуоресценцией в окне ближнего инфракрасного диапазона могут считаться перспективными зондами ближнего инфракрасного диапазона; Было показано, что они служат в качестве исключительного контрастного вещества для визуализации сосудов и лимфатических узлов, определения границ опухолей и хирургии под визуальным контролем [13,14,15,16]. Стоит отметить, что органический краситель индоцианиновый зеленый (ICG) - единственный флуоресцентный контрастный агент NIR, одобренный Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для использования у людей [17]. В то же время зонды молекулярной визуализации (например, красители или комплексы красителей) имеют ограничения, связанные с необходимостью модификации их молекулярной структуры для изменения характеристик их биозондов (например, растворимости в воде, проницаемости клеток и т. Д.) Или предоставления им других изображений или методы нацеливания. Напротив, поверхность наночастиц (НЧ), содержащих центры ФЛ, может быть ковалентно модифицирована различными частями для улучшения диспергируемости и стабильности в воде, контролируемого заряда поверхности или нацеливания. Кроме того, внедрение наноплатформ NIR-SWIR PL позволяет комбинировать визуализацию PL с другими методами визуализации, диагностики или лечения. Недавние исследования сообщают о визуализации глубоких тканей, всего тела, опухоли или транскраниальной области с помощью излучающих SWIR наноформ, используемых для мониторинга различных процессов in vivo [14, 18, 19, 20, 21]. Среди различных сообщенных нанозондов, излучающих в ближнем и инфракрасном диапазоне для визуализации in vivo, можно выделить два типа:с флуоресценцией в ближнем ИК-диапазоне, обусловленной органическими фрагментами (т. Е. Сопряженным полимером) или керамическими (например, фторидными) нанокристаллами, легированными ионами редкоземельных элементов. Наночастицы на основе полимеров (ПНЧ) являются одними из самых успешных наномедицинских препаратов в клинической практике благодаря относительной простоте синтеза и химической функционализации, а также превосходной биосовместимости и биоразлагаемости [22]. При загрузке флуорофоров NIR-SWIR, PNP могут служить в качестве многообещающих зондов для визуализации или средств доставки лекарств под визуализацией [23, 24]. С другой стороны, наночастицы, легированные редкоземельными ионами (RENP), представляют собой хорошо известный класс нанозондов, которые обладают уникальными фотолюминесцентными свойствами, доступными как посредством процессов преобразования с повышением частоты (антистоксово сдвиг), так и понижающего преобразования (со сдвигом Стокса). [25,26,27,28,29,30]. Недавно RENP были переведены для использования в визуализации NIR-SWIR. В отличие от зондов NIR-SWIR на основе органических компонентов, они обладают высоким квантовым выходом, исключительной фотостабильностью и узкими полосами излучения во всей спектральной области NIR-SWIR, которую можно регулировать путем легирования различными ионами [20, 31, 32]. RENP применялись для визуализации сосудистой сети и органов мелких животных, обнаружения опухолей, мультиплексной и мультиспектральной визуализации [3, 19, 20, 33,34,35].

С появлением биоимиджинга PL способность одновременно отслеживать несколько фрагментов PL in vivo может потребоваться для различных целей (например, для целенаправленной визуализации выбранных клеток или органов вместе с доставкой лекарств под контролем визуализации). Для решения этой проблемы были разработаны методы мультиплексной визуализации. Мультиплексная визуализация означает взаимодополняемость анатомической и функциональной информации в отображаемой биологической системе; его применение может позволить комбинировать биомаркеры визуализации, контрасты и методы для повышения полезности визуализации в исследованиях и клинических применениях [36]. Мультиплексная визуализация PL может усилить тераностический аспект наномедицины, предлагая возможность ввести несколько контрастов визуализации PL наряду с терапевтическим воздействием. Наиболее часто используемые методы мультиплексной визуализации различают зонды ФЛ по спектральному положению их излучения ФЛ с использованием соответствующих оптических фильтров [37,38,39]. Однако правильное мультиплексирование в таком подходе требует использования нанозондов со спектрально узкими, неперекрывающимися спектрами ФЛ. В этом отношении гиперспектральная визуализация (HSI) в сочетании с алгоритмами анализа спектральной смеси является многообещающим инструментом для мультиплексирования PL. Однако биомедицинские применения PL HSI в основном ограничиваются флуоресцентной микроскопией для мультиплексирования различных типов нанозондов и устранения фона и автофлуоресценции [40, 41]. Что касается HSI in vivo, он наиболее часто используется в режиме отражения-визуализации посредством сбора и последовательного анализа спектров отражения тканей [42], хотя HSI-визуализация in vivo (также называемая мультиспектральной визуализацией) также описывалась для PL в видимой области спектра. и БИК [3, 5]. Однако сообщений о HSI нанозондов, излучающих SWIR, в литературе найти не удалось.

Недавно мы сообщили о разработке системы HSI с последовательной последовательностью полос в сочетании с программным обеспечением спектрального несмешивания для формирования изображений SWIR PL [43]. Последовательная процедура HSI по полосам была основана на последовательном получении 2D-изображений через элемент со спектрально изменяемым коэффициентом пропускания (то есть перестраиваемый жидкокристаллический фильтр, LCTF). Данные SWIR PL, полученные из суспензий RENP, были представлены в виде трехмерного куба спектральных данных (гиперкуба), содержащего два пространственных и одно спектральное измерения. Дальнейшее применение процедуры спектрального разложения к каждому пространственному пикселю полученного гиперкуба позволило рассчитать содержания в компоненте смеси ФЛ. Здесь мы применили HSI для решения проблемы мультиплексирования нанозондов для биовизуализации SWIR PL in vivo. Мы использовали два типа наночастиц, излучающих SWIR, с излучениями, которые перекрывают друг друга по спектру и не могут быть легко различимы при традиционной визуализации ФЛ с оптическими фильтрами, несмотря на их различный спектральный профиль. На рисунке 1 показана проблема спектральной смеси ФЛ от этих наночастиц и способ ее преодоления с помощью последовательного разделения полос с HSI.

Схема, иллюстрирующая применение HSI для мультиплексирования фотолюминесцентных нанозондов

HSI применялся для получения спектрально-селективных и чувствительных изображений ФЛ для обоих типов наночастиц. Чтобы разделить спектральные профили SWIR PL, был разработан протокол разделения, позволяющий получить количественное и пространственное картирование компонентов в смеси с определением распределения интенсивности в дополнение к содержанию. Методы SWIR HSI и разработанный протокол разделения были в дальнейшем применены к визуализации in vivo мышей, которым подкожно инъецировали наночастицы, чтобы продемонстрировать применимость HSI для мультиплексирования нанозондов SWIR PL при визуализации in vivo.

Методы

Подготовка и характеристика наноформулировок

Синтез полимерных наночастиц "ядро-оболочка", содержащих органический флуоресцентный краситель NIR-SWIR

Полистирол (ПС) -поли- N Наночастицы ядро-оболочка -изопропилакриламид (ПНИПАМ) были синтезированы методом микроэмульсионной полимеризации с модификацией метода, описанного ранее [44, 45]. Во-первых, наночастицы ядра ПС-со-ПНИПАМ (10 мас.% ПНИПАМ) получали следующим образом. НИПАМ (0,1 г), додецилсульфат натрия SDS (0,1 г) и 0,005 г NaH ₂ ЗП ₄ × H ₂ O растворяли в 45 мл H ₂ О. Стирол (1 г) добавляли по каплям при интенсивном перемешивании, когда температура повышалась до 60 ° C. На следующем этапе в смесь барботировали Ar в течение 30 минут, температуру повышали до 70 ° C и 0,08 г K ₂ S ₂ О ₈ растворяется в 1 мл H ₂ O вводили для инициирования полимеризации. Во-вторых, оболочка PNIPAM была наложена на ядро ​​PS-co-PNIPAM. Для этого в реактор добавляли водный раствор мономера НИПАМ (1,8 г) и сшивающего агента N . , N ′ -Метиленбисакриламид (BIS) (0,18 г) в 4 мл H ₂ O с помощью шприца. Реакции давали возможность продолжаться в течение 4 ч при 70 ° C. Смесь охлаждали до комнатной температуры и диализовали в течение 74 ч с использованием целлюлозной мембраны с MWCO 3500 Да. В результате была изготовлена ​​суспензия наночастиц ПС-ПНИПАМ; структура ядро-оболочка наночастиц четко выявляется на изображениях просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (рис. 3а). Чтобы получить NIR-SWIR флуоресцентные PNP, 2-бутил-6- [5- (2-бутил-1,3-диметилциклогепта [c] пиррол-6 (2H) -илиден) пента-1,3-диен Флуоресцентный краситель [46] -1-ил] -1,3-диметилциклогепта [c] пирролиум тетрафторборат (обозначенный как JB9-08) был загружен [47] в наночастицы PS-PNIPAM. Восемь микролитров 1 мМ раствора красителя JB9-08 в ДМФА добавляли к 2 мл 0,25% водной суспензии ПНФ и выдерживали в течение 24 часов перед использованием.

Синтез RENP Core-Shell

RENP были синтезированы в соответствии с модифицированным протоколом, описанным в другом месте [48]. Во-первых, α-NaYF ₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ Ядро наночастиц получали разложением трифторацетата металла при высокой температуре. В типичной процедуре 0,05 ммоль Yb ₂ О ₃ , 0,15 ммоль Nd ₂ О _3, и 0,25 ммоль Y ₂ О ₃ загружали в колбу на 250 мл, содержащую 5 мл деионизованной воды и 5 мл TFA, и нагревали до 90 ° C в течение 1 ч с получением прозрачного раствора. Полученный прозрачный раствор упаривали при этой температуре в атмосфере аргона, чтобы получить мутный порошкообразный RE (TFA) ₃ . . Затем в колбу добавляли 8 мл OA, 8 мл OM, 12 мл ODE и 2 ммоль NaTFA. Раствор нагревали до 120 ° C и выдерживали при этой температуре в течение 30 минут с последующим нагреванием до 300 ° C в течение 30 минут перед естественным охлаждением до комнатной температуры. В течение всего процесса синтеза применялась среда аргона. Полученные наночастицы осаждали добавлением 20 мл этанола в охлажденную реакционную колбу. После трехкратной промывки этанолом на центрифуге собранный белый порошок окончательно диспергировали в 10 мл гексана для дальнейшего использования.

Во-вторых, α-NaYF ₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF ₂ RENP ядро-оболочка получали посредством процесса эпитаксиального роста, опосредованного семенами, с использованием α-NaYF ₄ :10% Yb ³⁺ , x% Nd ³⁺ ядро в качестве затравки и соответствующий рост в растворе предшественника оболочки. Для приготовления предшественника оболочки сначала в колбу емкостью 250 мл добавляли 2 ммоль CaO с 5 мл деионизированной воды и 5 мл TFA и нагревали при 90 ° C в течение 1 ч до получения прозрачного раствора. Этот раствор затем упаривали при этой температуре, чтобы получить предшественник оболочки трифторацетата кальция (Ca (TFA) ₂ ). Далее 0,5 ммоль NaYF ₄ . :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ Все наночастицы ядра, 7 мл OA и 7 мл ODE были добавлены в колбу. Затем раствор нагревали до 120 ° C в течение 30 минут с последующим нагреванием до 300 ° C в течение 60 минут перед естественным охлаждением. Весь процесс проводился в среде аргона. Полученные наночастицы ядро-оболочка осаждали добавлением 20 мл этанола в охлажденную реакционную колбу. После трехкратной промывки этанолом в центрифуге собранные НЧ ядро-оболочка наконец диспергировали в 10 мл гексана для дальнейшего использования. Для приготовления водной дисперсии приготовленный α-NaYF ₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF ₂ RENP ядро-оболочка (5 мл гексановой дисперсии) сначала смешивали с 5 мл N , N -Диметилформамид (ДМФ) раствор тетрафторбората нитрозония (NOBF ₄ ) (0,1 М) при комнатной температуре. Смесь осторожно встряхивали до тех пор, пока не наблюдалось осаждение RENP. Затем к смеси добавляли толуол и гексан (1:1 по объему), после чего смесь центрифугировали при 10000 об / мин в течение 10 мин. Осадок собирали и диспергировали в 5 мл ДМФ. Во-вторых, 250 мг поли (акриловой кислоты) (PAA, MW =18000) добавляли к 5 мл раствора NOBF ₄ в ДМФ. -обработанные RENP, которые нагревали до 80 ° C и выдерживали при этой температуре в течение 30 мин при интенсивном перемешивании. После этого НЧ осаждали добавлением ацетона, промывали этанолом и, наконец, диспергировали в дистиллированной воде.

Просвечивающая электронная микроскопия

Морфологию PNP и RENP оценивали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Чтобы получить изображение с помощью ПЭМ, 10 мкл суспензии наночастиц были каплями на углеродные опорные пленки, стабилизированные формваром. Чтобы визуализировать структуру ядро-оболочка ПНЧ, их отрицательно окрашивали 1% -ным водным раствором фосфорновольфрамовой кислоты перед тем, как капать на поддерживающие пленки. Пленки углеродного носителя сушили на воздухе и промывали 5 мкл чистой воды. Изображения были получены при работе при ускоряющем напряжении 100 кВ на ПЭМ (JEM-1230, JEOL).

Фотолюминесцентная спектроскопия

Спектры ФЛ для обоих типов наночастиц были измерены в ближнем и ближнем инфракрасном диапазонах с использованием спектрофлуориметра Fluorolog-3, оснащенного спектрометром iHR320 для диапазона NIR-SWIR (Horiba); волоконно-оптический лазерный диод, излучающий на длине волны 808 нм (QSP-808-4, QPhotonics), использовался для возбуждения ФЛ от PNP и RENP.

Система гиперспектральной визуализации

Встроенная система SWIR HSI использует метод последовательной регистрации полос (рис.2) и включает в себя камеру NIR (Xeva-1.7-320, Xenics, Бельгия), фокусирующую оптику (TEC-M55MPW, Computar, США) и перестраиваемый жидкокристаллический фильтр (Varispec LNIR). 20-HC-20, PerkinElmer, США) в качестве диспергирующего элемента. Система имеет разрешение 340 × 258 пикселей и работает в спектральном диапазоне 900–1700 нм. Источники освещения в системе включают в себя лампу накаливания (для совмещения изображений, фокусировки и визуализации в ярком поле) и 808-нм волоконно-оптический лазерный диод (QSP-808-4, QPhotonics, США), питаемый от источника питания лазера (Laser Source 4308). , Arroyo Instruments, США) для возбуждения ФЛ при визуализации ФЛ. Сбор куба спектральных данных осуществлялся путем последовательной настройки пропускания LCTF для ширины спектра 20 нм в диапазоне от 900 до 1200 нм с шагом 10 нм и захвата соответствующих изображений. Время экспозиции NIR-камеры во время сбора данных HSI было установлено на 200 мс. Плотность лазерной мощности на образце была зафиксирована на уровне ~ 100 мВт / см ² . . Для получения изображений PL во всем диапазоне NIR-SWIR LCTF был заменен фильтром с длиной волны 850 нм (Edmund Optics, США).

Принципиальная схема системы гиперспектральной визуализации NIR-SWIR

Программное обеспечение Spectral Unmixing

Для анализа полученного куба спектральных данных был разработан алгоритм спектрального разделения в среде MATLAB. Спектр каждого пикселя рассматривается как линейная смесь известных конечных членов:\ (F \ left (\ lambda \ right) =\ sum \ limits_i {a} _i {G} _i \ left (\ lambda \ right) \), где F ( λ ) - спектр пикселей, G _я - спектры концевых членов и a _я - обилие конечных членов. Программа размешивания предназначена для оценки количества известных конечных элементов путем решения задачи линейного спектрального анализа смеси (LSMA) в каждом пикселе куба собранных спектральных данных. Предположим, L - количество спектральных полос, а p количество концевых членов, присутствующих в смеси. Тогда проблема LSMA может быть обозначена как F = Га + n , где F это L × 1 вектор яркости пикселей, G это L × p матрица, содержащая все векторы конечных членов, a это p × 1 вектор неизвестной численности и n это L × 1 вектор ошибок. Метод на основе ошибки наименьших квадратов (LSE) для решения задачи LSMA может быть сформирован как следующая оптимизационная задача:min _a {( F - Га ) ^Т ( F - Га )}, а классическим решением является a ( г ) =( G ^Т G ) ⁻¹ G ^Т F . Однако такое решение может содержать отрицательные значения содержания, не имеющие физического смысла. Чтобы устранить это препятствие, необходимо изменить задачу оптимизации LSE:min _a {( F - Га ) ^Т ( F - Га )} при условии a ≥ 0. Для решения этой задачи мы используем итерационный алгоритм, основанный на линейном спектральном анализе смеси с ограничениями на неотрицательность (NC-LSMA), который подробно описан в [49, 50]. После расчета содержания для каждого компонента они отображаются в виде двухмерных цветовых диаграмм. Наконец, программа размешивания дает изображения интенсивности соответствующих компонентов на основе полученных значений содержания:\ ({I} _i \ left (x, y \ right) ={a} _i \ left (x, y \ right) \ sum \ limits_ {\ lambda} {G} _i \ left (\ lambda \ right) \), где I _я ( x , y ) - интегральная интенсивность i -й конечный элемент в пикселях и a _я ( x , y ) - я -я изобилие.

Эксперименты на животных

Голых мышей BALB / c (Источник:Лаборатория Джексона, США) разводили в темноте и в асептических условиях в небольшом помещении для животных. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с критериями Национального регламента Китая по уходу и использованию лабораторных животных. Перед визуализацией самцов голых мышей (возраст 6 недель, 20 ± 2 г) анестезировали 5% хлоралгидратом (0,06 мл на грамм веса мыши) путем внутрибрюшинной инъекции. Для визуализации SWIR PL in vivo наночастицы суспендировали в 10-кратном фосфатно-солевом буфере (PBS) и мышам подкожно вводили по 100 мкл каждой суспензии PBS, PNP, RENP или их смеси.

Результаты и обсуждение

Для использования в HSI были приготовлены два типа SWIR-фотолюминесцентных НЧ:(1) ПНЧ после нагрузки красителем JB9-08, который практически не флуоресцирует в водных растворах [46], но, как показано нами [51], восстанавливает его флуоресценция в воде за счет последующей загрузки в полимерную матрицу PNP (рис. 3a и b) и (2) NaYF, покрытого PAA ₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF ₂ наночастицы, легированные редкоземельными ионами, ядро-оболочка (RENPs, рис. 3c и d). Nd ³⁺ ионы в ядре RENP могут быть возбуждены светом с длиной волны ~ 808 нм ( ⁴ Я _9/2 → ⁴ F _5/2 переход) и передать энергию Yb ³⁺ ионы, которые излучают в диапазоне 950–1100 нм с пиком на ~ 975 нм ( ² F _5/2 → ² F _7/2 переход). Ядро RENPs было покрыто инертным CaF ₂ оболочка для уменьшения безызлучательных потерь через поверхностные дефекты и взаимодействие с окружающей средой [48]. Оба нанообразования проявляют фотолюминесценцию в диапазоне 900–1200 при возбуждении 808 нм (рис. 3e).

Характеристика PNP и RENP. Изображение TEM ( a ) и схематическая структура ( b ) ПНП с красителем ЖБ9-08. Изображение TEM ( c ) и схематическая структура ( d ) РЕНП. е Нормализованные спектры излучения ФЛ суспензий PNP-JB9-08 и RENP при возбуждении 808 нм. Масштабные линейки, 100 нм

Следует отметить, что спектры излучения ФЛ наночастиц, полученные с помощью спектрофлуориметра, нельзя использовать в качестве конечных элементов в программном обеспечении спектрального размешивания по двум причинам. Во-первых, чувствительность системы HSI не корректируется спектрально, в отличие от обычного спектрофлуориметра, поэтому полученный спектральный профиль излучения отличается для двух методов сбора данных. Во-вторых, кадры HSI собираются с шагом 10 нм, хотя спектральная ширина полосы LCTF составляет 20 нм. Это приводит к наложению сигнала на соседние кадры, вызывая искажение полученного спектрального профиля по сравнению с измеренным спектрофлуориметром. Для преодоления этих препятствий были получены концевые элементы (спектральные профили образцов PNP и RENP) с помощью системы HSI. С этой целью оба типа нанозондов суспендировали в PBS, а их суспензии PBS помещали в микроцентрифужные пробирки (рис. 4а). При обычной визуализации ФЛ трудно различить два образца, так как их спектры излучения ФЛ перекрываются (рис. 4б и 3д). С помощью системы HSI было получено 31 изображение ФЛ в спектральном диапазоне от 900 до 1200 нм с шагом 10 нм (рис. 4в). Спектральные профили PNP, RENP и фона (BG) были рассчитаны через спектральный размер куба спектральных данных путем усреднения сигнала в областях, отмеченных красным, синим и зеленым квадратами соответственно (рис. 4b). Полученные спектральные профили для PNP и RENP (рис. 4d) оказались похожими на профили, измеренные спектрофлуорометром, и позже были использованы в качестве конечных элементов для спектрального разделения. После этого, со спектральными профилями PNP, RENP и BG в качестве конечных членов, соответствующие содержания компонентов рассчитываются и наносятся на карту в виде двухмерных цветовых диаграмм (рис. 4e). Численность рассчитывалась для каждого пространственного пикселя гиперкуба и представлялась в виде значения от 0 до 1, где 0 и 1 указывали на полное отсутствие и полное содержание компонента, соответственно. Сумма содержаний всех компонентов в каждом пикселе равна 1. Следует отметить, что программное обеспечение размешивания использовало пороговое значение по интенсивности сигнала для устранения ошибок, вызванных пикселями с низкой интенсивностью. Если максимальная интенсивность пикселя по спектральному измерению составляла менее 5% от максимума всего гиперкуба, такой пиксель считался полностью изобилующим шумовой составляющей. Кроме того, изображения интегральной интенсивности PNP и RENP были рассчитаны с учетом соответствующих содержаний и исключения фонового компонента (рис. 4f). Как и ожидалось, картирование содержания и изображения интегральной интенсивности демонстрируют полное содержание PNP в правой трубке и RENP в левой трубке с небольшой ошибкой, вызванной рассеянием излучения PL и несовершенством алгоритма разделения.

HSI микроцентрифужных пробирок, содержащих RENP и PNP. а Изображение в светлом поле микроцентрифужных пробирок с PNP и RENP, суспендированными в PBS. б Изображение ФЛ образцов PNP и RENP, возбужденных с длиной волны 808 нм (для получения изображения использовался фильтр с длинной полосой 850 нм). c Схема, иллюстрирующая гиперкуб, составленный из фреймов HSI. г Спектральные профили PNP, RENP и фона (BG), усредненные из области интереса, показаны на b в виде красного, синего и зеленого квадратов соответственно. е Цветные карты содержания компонентов. е Восстановленные изображения интенсивности компонентов ФЛ и объединенное изображение ФЛ / светлого поля

Спектральное разделение также позволяет различать смесь PNP и RENP. Чтобы продемонстрировать это, три микроцентрифужные пробирки были заполнены растворами PNP, RENP и их смесью. После получения гиперкуба и процедуры спектрального разделения, картирование численности указывает на полное присутствие PNP в первой пробирке для микроцентрифуги, RENP во второй и смесь двух в третьей (рис. 5a). Далее была проведена реконструкция изображений интенсивности, чтобы выявить распределение интенсивности сигналов PL PNP и RENPs в образце (рис. 5b).

HSI микроцентрифужных пробирок, содержащих (слева направо) RENP, PNP и их смесь. а Обилие PNP, RENP и фон (BG). б Восстановленные изображения интенсивности ФЛ и объединенное изображение ФЛ / светлого поля

Мы также продемонстрировали применимость нашего метода HIS для мультиплексирования спектрально перекрывающихся нанозондов при визуализации SWIR PL in vivo. Голой мыши анестезировали и подкожно вводили PNP, RENP и их смесь. На изображении в ближнем ИК-диапазоне с фильтром длиной 850 нм видны три неотличимых фотолюминесцентных пятна (рис. 6а). После выполнения HSI и анализа картирование численности показывает полное содержание PNP и RENP в верхнем и нижнем местах инъекции, соответственно, в то время как смесь двух была идентифицирована в левом месте инъекции (рис. 6b). Кроме того, для получения распределения интенсивности ФЛ была проведена реконструкция интенсивности (рис. 6в). Установив значение порога в программном обеспечении размешивания на 15% (оценено эмпирически), стало возможным удалить шум в областях, прилегающих к точкам выбросов (рис. 6d). Такие результаты показывают, что в отличие от обычного метода визуализации PL, в котором используются длинные или полосовые оптические фильтры, HSI не только может отображать распределение интенсивности в образце, но также может мультиплексировать компоненты, присутствующие в смеси, идентифицируя спектральный профиль интенсивности в каждый пиксель изображения.

HSI мыши подкожно инъецировали PNP (верхний правый участок инъекции), RENP (нижний правый) и смесь RENP / PNP (слева). а Яркое поле (SWIR), SWIR PL и объединенные изображения, полученные с использованием эмиссионного фильтра длиной 850 нм. б Обилие PNP, RENP и фон (BG). c Соответствующие восстановленные изображения интенсивности. г Изображения интенсивности ФЛ, восстановленные по содержанию с пороговым уровнем 15%, и объединенное изображение ФЛ / светлого поля.

Таким образом, комбинация сбора данных HSI и обработки спектрального разделения была применена в этой работе для получения мультиплексированного изображения спектрально перекрывающихся нанозондов SWIR PL. Однако следует рассмотреть несколько вопросов в отношении применимости метода HSI. First, due to the spectrally narrow acquisition, every HSI frame deals with relatively low signal intensity (especially in the case of the spectrally broad PL emission form the organic moieties). In addition, an increase in the PL exciting laser power in biological imaging is limited by danger of tissue damage (or phototoxicity). This results in higher requirements for the brightness of the PL probes and their photostability, as HSI can require order of magnitude longer acquisition time in comparison with conventional PL imaging. It should also be noted that the linear mixture analysis and spectral unmixing algorithm can work satisfactorily for multiplexed PL imaging of biological tissues in the spectral range where tissue transmittance does not change much. In contrast, if tissue transmittance has distinctive features in the spectral range of HSI, linear spectral mixture model may be hardly applicable (especially in case of deeper tissues) and nonlinear models can be considered.

Выводы

In conclusion, we developed a hyperspectral SWIR bioimaging technique and applied it for multiplexing of nanoparticles emitting in SWIR spectral range. Two types of nanoparticles with overlapping PL spectra, which are undistinguishable in conventional imaging, were successfully multiplexed by their PL spectral profiles using hyperspectral acquisition along with the linear spectral mixture analysis algorithm. The developed method was successfully employed for multiplexed imaging of SWIR PL nanoparticles both in sample suspensions and injected in small animals. With SWIR bioimaging having superior resolution at higher imaging depth, SWIR HSI approach holds a great potential for use in various applications requiring multiplexed imaging with NIR-SWIR PL nanoprobes. Furthermore, as SWIR bioimaging is at a very early stage, there is plenty of room for the development of biomedical applications of PL probes in a combination with HSI.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью.

Сокращения

BG:

Background

HSI:

Hyperspectral imaging

LCTF:

Liquid crystal tunable filter

NIR:

Ближний инфракрасный порт

НП:

Наночастицы

PL:

Фотолюминесценция

PNIPAM:

Поли- N -isopropylacrylamide

PNPs:

Polymeric nanoparticles

PS:

Полистирол

RENPs:

Rare-earth doped fluoride nanoparticles

SWIR:

Short-wave infrared

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия