Продвинутая гиперспектральная визуализация для мультиплексного обнаружения нанозондов в коротковолновом инфракрасном диапазоне в биологических системах

Аннотация

Оптическая биовизуализация с экзогенными люминофорами, излучающими в коротковолновом инфракрасном (КВИ, ~1000–1700 нм) спектральном диапазоне, представляет собой быстро развивающуюся область, и в последнее время сообщалось о разработке нескольких КВИ-фотолюминесцентных нанозондов. В этом контексте гиперспектральная визуализация (ГСВ), комбинированная с алгоритмами ансамблирования, является перспективным инструментом, позволяющим эффективно мультиплексировать КВИ-излучающие наноагенты по их фототолюминесцентным (ФЛ) спектральным профилям. Описанная здесь техника КВИ ГСВ разработана для мультиплексирования двух типов нанозондов: полимерных наночастиц, легированных органическим красителем (PNPs), и фторидных наночастиц, легированных редкоземельными ионами (RENPs). Оба типа нанозондов демонстрируют ФЛ в одном и том же спектральном диапазоне (~900–1200 нм), что затрудняет спектральное разделение ФЛ с помощью оптических фильтров и ограничивает возможности их мультиплексной визуализации в биологических тканях. Применяя КВИ ГСВ, мы использовали различия в ФЛ спектральных профилях и достигли спектрально селективной и чувствительной визуализации ФЛ сигнала от каждого типа наночастиц. Ансамблирование полученных данных позволило мультиплексировать спектрально перекрывающиеся нанозонды по их ФЛ профилю. Были получены как количественная, так и пространственная распределение для каждого типа наночастиц из их смешанных суспензий. Наконец, техника КВИ ГСВ с протоколом ансамблирования была применена к ин виво визуализации мышей, подкожно инъецированным PNPs и RENPs. Применимость гиперспектральных техник для мультиплексирования нанозондов при ин виво визуализации была успешно продемонстрирована.

Введение

Биомедицинские технологии визуализации стремительно развивались в последние десятилетия, позволяя раннее обнаружение и оценку различных заболеваний и патологий. Среди различных модальностей визуализации оптическая визуализация занимает уникальное положение благодаря высокому пространственному и временному разрешению и относительно низкой стоимости. Множество подходов оптической визуализации, основанных на фотолюминесценции (или, точнее, флуоресценции), разрабатываются и клинически внедряются. Например, визуализация лимфатической системы и внутриоперационная флуоресцентно-навигационная хирургия показали перспективные результаты для улучшения здравоохранения [1, 2]. С другой стороны, экзогенные фотолюминесцентные зонды, нацеленные на конкретные области интереса (например, опухоль), активно разрабатываются для ин виво и экс виво визуализации. Помимо обычных требований к ФЛ зондам (высокая поглощающая способность, квантовый выход излучения и фотостабильность), спектральное положение и форма ФЛ излучения также являются критическими параметрами. Поскольку затухание света биологическими тканями известно как более низкое в ближнем инфракрасном (БИК) спектральном диапазоне (~700–950 нм), чем в видимом, был введен термин «БИК окно прозрачности» для биологических тканей (~700–950 нм), и значительные усилия посвящены разработке и применению БИК-излучающих зондов [3–6]. Более того, недавние достижения привели к введению второго и третьего БИК окон (БИК-II и БИК-III) в спектральном диапазоне ~1000–1700 нм, который часто называют коротковолновым инфракрасным (КВИ), особенно производителями в быстро развивающейся области инфракрасной визуализации [7–9]. Несмотря на более высокое поглощение воды в КВИ диапазоне по сравнению с обычным БИК окном, более низкая автофлуоресценция и рассеяние биологических тканей позволяют достичь более высокого разрешения визуализации и большей глубины проникновения в КВИ ФЛ биовизуализации [10–12]. Например, в КВИ ФЛ визуализации лимфатической и мозговой сосудистой системы с использованием нового КВИ флуоресцентного красителя CH1055-PEG было показано, что разрешение и отношение сигнал/фон превосходят обычную БИК ФЛ визуализацию с БИК-I флуоресцентным красителем индицианин зеленый [13]. Кроме того, использование КВИ-излучающих нанозондов (однозенковые углеродные нанотрубки) и КВИ камеры позволило группе Dai визуализировать сосуды менее 10 мкм на глубине >2 мм при неинвазивной (без краниотомии) визуализации цереброваскулатуры мышей, что недоступно для ФЛ визуализации в видимом или БИК-I диапазонах [8].

Органические красители и комплексы красителей с интенсивным поглощением в первом БИК окне и флуоресценцией в БИК-II окне могут рассматриваться как перспективные БИК-КВИ зонды; они демонстрировали себя как исключительные контрастные агенты для визуализации сосудов и лимфатических узлов, определения границ опухоли и образцовой хирургии [13–16]. Стоит отметить, что органический краситель индицианин зеленый (ICG) является единственным БИК флуоресцентным контрастным агентом, в настоящее время одобренным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США для использования у людей [17]. В то же время молекулярные образцовые зонды (красители или комплексы красителей) имеют ограничения, связанные с необходимостью модификации их молекулярной структуры для изменения биозондовых характеристик (например, водорастворимости, проницаемости клеток) или оснащения их другими визуализирующими или таргетирующими модальностями. В противовес этому, наночастицы (НЧ), содержащие ФЛ центры, могут иметь свою поверхность ковалентно модифицированной различными моетиями для улучшения водорастворимости и стабильности, контроля поверхностного заряда или таргетирования. Кроме того, внедрение БИК-КВИ ФЛ наноплатформ позволяет комбинировать ФЛ визуализацию с другими диагностическими или терапевтическими модальностями. Недавние исследования сообщают о глубокой тканевой, целого тела, опухолевой или транскраниальной визуализации с КВИ-излучающими наноформуляциями для мониторинга различных процессов ин виво [14, 18–21]. Среди различных сообщенных БИК-КВИ-излучающих нанозондов для ин виво визуализации можно выделить два типа: с БИК-КВИ флуоресценцией, возникающей от органических моетией (сопряженные полимеры) или керамических (например, фторидных) нанокристаллов, легированных редкоземельными ионами. Полимерные наночастицы (PNPs) являются одними из наиболее успешных нанолекарств в клиническом переводе благодаря относительной легкости синтеза и химической функционализации, а также превосходной биосовместимости и биоразлагаемости [22]. Загруженные БИК-КВИ флуорофорами, PNPs могут служить перспективными образцовыми зондами или носителями для образцовой доставки лекарств [23, 24]. С другой стороны, наночастицы, легированные редкоземельными ионами (RENPs), представляют хорошо известный класс зондов, обладающих уникальными фототолюминесцентными свойствами, доступными как через анти-Стоксовские (апконверсию), так и через Стоксовские (даунконверсию) процессы [25–30]. Недавно RENPs были адаптированы для использования в БИК-КВИ визуализации. В отличие от органических моетией БИК-КВИ зондов, они обладают высоким квантовым выходом, исключительной фотостабильностью и узкими полосами излучения во всем БИК-КВИ спектральном регионе, которые могут быть настроены через легирование различными ионами [20, 31, 32]. RENPs применялись для визуализации сосудистых систем и органов малых животных, обнаружения опухолей, мультиплексной и мультиспектральной визуализации [3, 19, 20, 33–35].

С развитием ФЛ биовизуализации может возникнуть необходимость одновременного отслеживания нескольких ФЛ моетией ин виво для различных целей (например, таргетированная визуализация выбранных клеток или органов вместе с образцовой доставкой лекарств). Для решения этой задачи были разработаны методы мультиплексной визуализации. Мультиплексная визуализация относится к взаимодополняемости анатомической и функциональной информации в визуализируемой биологической системе; ее применение может позволить комбинировать образцовые биомаркеры, контрасты и модальности для повышения полезности визуализации в исследованиях и клинических приложениях [36]. Мультиплексная ФЛ визуализация может усилить тераностическую размерность наномедицины, предлагая возможность введения нескольких ФЛ визуализационных контрастов вместе с терапевтической модальностью. Наиболее часто используемые методы мультиплексной визуализации отличают ФЛ зонды по спектральному положению их ФЛ излучения, используя соответствующие оптические фильтры [37–39]. Однако правильное мультиплексирование в таком подходе требует использования нанозондов со спектрально узкими, неперекрывающимися ФЛ спектрами. В этом контексте гиперспектральная визуализация (ГСВ), комбинированная с алгоритмами спектрального анализа смесей, является перспективным инструментом для ФЛ мультиплексирования. Однако биомедицинские применения ФЛ ГСВ в основном ограничены флуоресцентной микроскопией для мультиплексирования различных типов нанозондов и устранения фона и автофлуоресценции [40, 41]. Что касается ин виво ГСВ, она чаще всего используется в режиме рефлексивной визуализации путем приобретения и последовательного анализа спектров отражения тканей [42], хотя ин виво ГСВ (также называемая мультиспектральной визуализацией) также сообщалась для ФЛ в видимом и БИК диапазонах [3, 5]. Однако в литературе не найдено отчетов о ГСВ КВИ-излучающих нанозондов.

Недавно мы сообщали о разработке последовательно-полосной ГСВ системы, комбинированной с программным обеспечением для спектрального ансамблирования, для КВИ ФЛ визуализации [43]. Процедура последовательно-полосной ГСВ основывалась на последовательном приобретении 2D изображений через элемент со спектрально изменяющейся пропусканием (жидкокристаллический настраиваемый фильтр, ЖКНФ). КВИ ФЛ данные, полученные от суспензий RENPs, представлялись как трехмерный спектральный куб данных (гиперкуб), содержащий два пространственных и одно спектральное измерение. Дальнейшее применение процедуры спектрального ансамблирования к каждому пространственному пикселю приобретенного гиперкуба позволяло рассчитывать изобилия компонентов ФЛ смеси. Здесь мы применили ГСВ для решения задачи мультиплексирования нанозондов для ин виво КВИ ФЛ биовизуализации. Мы использовали два типа КВИ-излучающих наночастиц с излучением, перекрывающимся спектрально, которые не могут быть легко различимы в обычной ФЛ визуализации с оптическими фильтрами, несмотря на их различные спектральные профили. Рис. 1 иллюстрирует проблему спектральной смеси ФЛ от этих наночастиц и способ ее преодоления с использованием последовательно-полосного ансамблирования с ГСВ.

ГСВ применялась для приобретения спектрально селективной и чувствительной ФЛ визуализации для обоих типов наночастиц. Для ансамблирования КВИ ФЛ спектральных профилей был разработан протокол ансамблирования, позволяющий получить количественное и пространственное картирование компонентов в смеси с определением распределений интенсивностей в дополнение к изобилиям. Техника КВИ ГСВ и разработанный протокол ансамблирования были далее применены к ин виво визуализации мышей, подкожно инъецированным наночастицами, для демонстрации применимости ГСВ для мультиплексирования КВИ ФЛ нанозондов при ин виво визуализации.

Методы

Подготовка и характеристика наноформуляций

Синтез полимерных ядро-оболочечных наночастиц, загруженных органическим флуоресцентным БИК-КВИ красителем

Полистирол (PS)-поли-N-изопропилакриламид (PNIPAM) ядро-оболочечные наночастицы были синтезированы методом микрополимеризации с модификацией ранее описанного метода [44, 45]. Сначала готовились ядерные наночастицы PS-co-PNIPAM (10 м.% PNIPAM). NIPAM (0,1 г), додецилсульфат натрия SDS (0,1 г) и 0,005 г NaH₂PO₄ × H₂O растворялись в 45 мл H₂O. Стирол (1 г) добавлялся капельно при интенсивном перемешивании при нагреве до 60 °C. Затем в течение 30 мин через смесь пропускали аргон, температуру поднимали до 70 °C и вводили 0,08 г K₂S₂O₈, растворенного в 1 мл H₂О, для инициации полимеризации. Во втором этапе оболочка PNIPAM наносилась на ядро PS-co-PNIPAM. В реактор шприцем вводили водный раствор мономера NIPAM (1,8 г) и перекрестного агента N,N'-метиленбисакриламида (BIS) (0,18 г) в 4 мл H₂О. Реакция продолжалась 4 ч при 70 °C. Смесь охлаждали до комнатной температуры и диализировали 74 ч с использованием целлюлозной мембраны с МПК 3500 Да. В результате получалась суспензия PS-PNIPAM наночастиц; ядро-оболочечная структура четко проявляется на ТЭМ изображениях (Рис. 3a). Для получения БИК-КВИ флуоресцентных PNPs, флуоресцентный краситель 2-бутил-6-[5-(2-бутил-1,3-диметилциклогепта[c]пиррол-6(2H)-илиден)пента-1,3-диен-1-ил]-1,3-диметилциклогепта[c]пирролиум тетрафлуороборат (обозначенный как JB9-08) [46] был пост-загружен [47] в PS-PNIPAM наночастицы. 8 мкл 1 мМ раствора красителя JB9-08 в ДМФ добавляли к 2 мл 0,25 масс.% водной суспензии PNPs и выдерживали 24 ч перед использованием.

Синтез ядро-оболочечных RENPs

RENPs синтезировали по модифицированному протоколу, описанному ранее [48]. Сначала готовились ядерные наночастицы α-NaYF₄: 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺ методом термического разложения трифлуороацетатов металлов. В типичной процедуре 0,05 ммоль Yb₂O₃, 0,15 ммоль Nd₂O₃ и 0,25 ммоль Y₂O₃ загружали в 250-мл колбу, содержащую 5 мл деионизированной воды и 5 мл ТФА, и нагревали до 90 °C в течение 1 ч для получения прозрачного раствора. Полученный раствор испаряли при этой температуре под аргоном для получения грязно-бурошного порошкового RE(TFA)₃. Затем в колбу добавляли 8 мл OA, 8 мл OM, 12 мл ODE и 2 ммоль NaTFA. Раствор нагревали до 120 °C и выдерживали 30 мин, затем нагревали до 300 °C на 30 мин перед естественным охлаждением до комнатной температуры. Аргоновая среда поддерживалась на протяжении всего синтеза. Полученные наночастицы осаждали добавлением 20 мл этанола в охлажденную реакционную колбу. После трехкратной центрифужной промывки этанолом собранный белый порошок наконец диспергировали в 10 мл гексана для дальнейшего использования.

Во вторых, ядро-оболочечные α-NaYF₄: 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ RENPs готовили методом эпитаксиального роста от семени, используя α-NaYF₄: 10% Yb³⁺, x% Nd³⁺ ядерные наночастицы в качестве семени и соответствующий рост в растворе предшественника оболочки. Для приготовления предшественника оболочки сначала 2 ммоль CaO с 5 мл деионизированной воды и 5 мл ТФА добавляли в 250-мл колбу и нагревали при 90 °C в течение 1 ч для получения прозрачного раствора. Этот раствор затем испаряли при этой температуре для получения предшественника оболочки трифлуороацетата кальция Ca(TFA)₂. Затем 0,5 ммоль ядерных наночастиц NaYF₄: 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺, 7 мл OA и 7 мл ODE добавляли в колбу. Раствор нагревали до 120 °C на 30 мин, затем до 300 °C на 60 мин перед естественным охлаждением. Весь процесс проводили в аргоновой среде. Полученные ядро-оболочечные наночастицы осаждали добавлением 20 мл этанола, после трехкратной центрифужной промывки этанолом собранные ядро-оболочечные НЧ диспергировали в 10 мл гексана. Для приготовления водной дисперсии приготовленные α-NaYF₄: 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ ядро-оболочечные RENPs (5 мл гексановой дисперсии) сначала смешивали с 5 мл раствором нитрозиум тетрафлуоробората (NOBF₄) (0,1 М) в N,N-диметилформамиде (ДМФ) при комнатной температуре. Смесь слегка встряхивали до наблюдения осаждения RENPs. Затем добавляли толуол и гексан (1:1 по объему), центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Осадок собирали и диспергировали в 5 мл ДМФ. Во вторых, 250 мг поли(акриловой кислоты) (PAA, М = 18 000) добавляли к 5 мл ДМФ раствору NOBF₄-обработанных RENPs, нагревали до 80 °C и выдерживали 30 мин при интенсивном перемешивании. После этого НЧ осаждали добавлением ацетона, промывали этанолом и наконец диспергировали в дистиллированной воде.

Трансмиссионная электронная микроскопия

Морфология PNPs и RENPs оценивалась с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Для ТЭМ 10 мкл суспензии наночастиц наносили на углеродные подложки, стабилизированные формваром. Для визуализации ядро-оболочечной структуры PNPs их предварительно негативно окрашивали 1% водным раствором фосфовольфрамовой кислоты перед нанесением на подложки. Углеродные подложки сушили на воздухе и промывали 5 мкл чистой воды. Изображения получали на ТЭМ (JEM-1230, JEOL) при ускоряющем напряжении 100 кВ.

Фототолюминесцентная спектроскопия

ФЛ спектры обоих типов наночастиц измеряли в БИК и КВИ диапазонах с использованием спектрофлюорометра Fluorolog-3, оснащенного спектрометром iHR320 для БИК-КВИ диапазона (Horiba); для возбуждения ФЛ от PNPs и RENPs использовался волоконно-световодный лазерный диод с излучением 808 нм (QSP-808-4, QPhotonics).

Гиперспектральная визуализирующая система

Домашняя КВИ ГСВ система использует метод последовательного полосового приобретения (Рис. 2) и включает БИК камеру (Xeva-1.7-320, Xenics, Бельгия), фокусирующую оптику (TEC-M55MPW, Computar, США) и жидкокристаллический настраиваемый фильтр (Varispec LNIR 20-HC-20, PerkinElmer, США) как дисперсирующий элемент. Система имеет разрешение 340 × 258 пикселей и работает в спектральном диапазоне 900–1700 нм. Источники освещения включают лампу накаливания (для выравнивания, фокусировки и яркопольной визуализации) и 808-нм волоконно-световодный лазерный диод (QSP-808-4, QPhotonics, США), запитанный источником лазерной мощности (Laser Source 4308, Arroyo Instruments, США), для ФЛ возбуждения при ФЛ визуализации. Приобретение спектрального куба данных выполнялось последовательной настройкой пропускания ЖКНФ шириной 20 нм в диапазоне 900–1200 нм с шагом 10 нм и захватом соответствующих изображений. Выдержка БИК камеры при ГСВ приобретении составляла 200 мс. Плотность мощности лазера на образце фиксировалась на уровне ~100 мВт/см². Для приобретения ФЛ изображений во всем БИК-КВИ диапазоне ЖКНФ заменяли на 850-нм длинноволновой фильтр (Edmund Optics, США).

Программное обеспечение для спектрального ансамблирования

Для анализа полученного спектрального куба данных мы разработали алгоритм спектрального ансамблирования в среде MATLAB. Спектр каждого пикселя рассматривается как линейная смесь известных эндмемберов: F(λ) = Σ aᵢ Gᵢ(λ), где F(λ) — спектр пикселя, Gᵢ — спектры эндмемберов, aᵢ — их изобилия. Цель программного обеспечения — оценить изобилия известных эндмемберов, решая задачу линейного спектрального анализа смесей (LSMA) в каждом пикселе спектрального куба. Пусть L — число спектральных полос, p — число эндмемберов в смеси. Тогда задача LSMA формулируется как F = G a + n, где F — L×1 вектор интенсивностей пикселя, G — L×p матрица векторов эндмемберов, a — p×1 вектор неизвестных изобилий, n — L×1 вектор ошибки. Метод наименьших квадратов (LSE) для решения LSMA формируется как задача оптимизации: minₐ{(F − Ga)ᵀ(F − Ga)}, классическое решение: a = (GᵀG)⁻¹GᵀF. Однако такое решение может содержать отрицательные значения изобилий, не имеющие физического смысла. Для устранения этого LSE задачу модифицируют: minₐ{(F − Ga)ᵀ(F − Ga)}, при условии a ≥ 0. Для решения используем итеративный алгоритм, основанный на неотрицательно ограниченном линейном спектральном анализе смесей (NC-LSMA), описанный в [49, 50]. После расчета изобилий для каждого компонента они отображаются как 2D колормап графики. Программное обеспечение выдает интенсивностные изображения соответствующих компонентов на основе полученных изобилий: Iᵢ(x,y) = aᵢ(x,y) Σλ Gᵢ(λ), где Iᵢ(x,y) — интегральная интенсивность i-го эндмембера в пикселе, aᵢ(x,y) — i-е изобилие.

Эксперименты на животных

Голые мыши BALB/c (Источник: The Jackson Laboratory, США) содержали в темноте и асептических условиях в вивариуме малых животных. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с критериями Национального регламента Китая по уходу и использованию лабораторных животных. Перед визуализацией самцов голых мышей (6 недель, 20 ± 2 г) анестезировали 5% гидратом хлорала (0,06 мл на грамм веса мыши) внутрибрюшинно. Для КВИ ФЛ визуализации ин виво наночастицы взвешивали в 10x фосфатно-буферном растворе (ФБР) и 100 мкл каждой ФБР суспензии PNPs, RENPs или их смеси подкольно инъецировали в мышей.

Результаты и обсуждение

Для использования в ГСВ были подготовлены два типа КВИ-фототолюминесцентных НЧ: (1) PNPs, пост-загруженные красителем JB9-08, который практически не флуоресцирует в водных растворах [46], но, как мы показали [51], восстанавливает флуоресценцию в воде через пост-загрузку в полимерную матрицу PNPs (Рис. 3a и b) и (2) PAA-окрепленные NaYF₄:10%Yb³⁺,30%Nd³⁺@CaF₂ ядро-оболочечные наночастицы, легированные редкоземельными ионами (RENPs, Рис. 3c и d). Nd³⁺ ионы в ядре RENPs могут быть возбуждены светом ~808 нм (переход ⁴I₉/₂ → ⁴F₅/₂) и передают энергию ионам Yb³⁺, которые излучают в диапазоне 950–1100 нм с пиком ~975 нм (переход ²F₅/₂ → ²F₇/₂). Ядро RENPs покрыто инертной оболочкой CaF₂ для снижения нерадиационных потерь через поверхностные дефекты и взаимодействие с окружающей средой [48]. Обе наноформуляции демонстрируют фототолюминесценцию в диапазоне 900–1200 нм при возбуждении 808 нм (Рис. 3e).

Следует отметить, что ФЛ спектры излучения наночастиц, полученные на спектрофлюорометре, не могут использоваться как эндмемберы в программном обеспечении спектрального ансамблирования по двум причинам. Во-первых, чувствительность ГСВ системы не спектрально скорректирована, в отличие от обычного спектрофлюорометра, поэтому приобретенный спектральный профиль излучения отличается для двух методов приобретения. Во-вторых, ГСВ кадры собираются с шагом 10 нм, хотя спектральная полоса пропускания ЖКНФ составляет 20 нм. Это приводит к перекрытию сигнала в соседних кадрах, вызывая искажение полученного спектрального профиля по сравнению с измеренным на спектрофлюорометре. Для преодоления этих препятствий эндмемберы (спектральные профили образцов PNPs и RENPs) приобретали с ГСВ системой. С этой целью оба типа нанозондов взвешивали в ФБР и их ФБР суспензии помещали в микроцентрифужные тюбики (Рис. 4a). С обычной ФЛ визуализацией практически невозможно отличить два образца, так как их ФЛ спектры излучения перекрываются (Рис. 4b и 3e). Используя ГСВ систему, собирали 31 ФЛ изображение в спектральном диапазоне 900–1200 нм с шагом 10 нм (Рис. 4c). Спектральные профили PNPs, RENPs и фона (BG) вычисляли через спектральное измерение спектрального куба данных путем усреднения сигнала в областях, отмеченных красным, синим и зеленым квадратами соответственно (Рис. 4b). Полученные спектральные профили для PNPs и RENPs (Рис. 4d) оказались похожими на измеренные спектрофлюорометром и позже использовались как эндмемберы для спектрального ансамблирования. Далее, с профилями PNPs, RENPs и BG как эндмемберами, соответствующие изобилия компонентов рассчитывали и отображали как 2D колормап графики (Рис. 4e). Изобилия рассчитывались для каждого пространственного пикселя гиперкуба и представлялись как значение от 0 до 1, где 0 и 1 указывают на полное отсутствие и полное изобилие компонента соответственно. Сумма изобилий всех компонентов в каждом пикселе равна 1. Следует отметить, что программное обеспечение ансамблирования использовало пороговую фильтрацию по интенсивности сигнала для устранения ошибок, вызванных низкоинтенсивными пикселями. Если максимальная интенсивность пикселя по спектральному измерению была менее 5% от максимума всего гиперкуба, такой пиксель считался полностью изобилующим шумовым компонентом. Кроме того, интегральные интенсивностные изображения PNPs и RENPs рассчитывали с учетом соответствующих изобилий и исключением фонового компонента (Рис. 4f). Как и ожидалось, как картирование изобилий, так и интегральные интенсивностные изображения демонстрируют полное изобилие PNPs в правом тюбике и RENPs в левом, с незначительной ошибкой, вызванной рассеянием ФЛ излучения и несовершенством алгоритма ансамблирования.

Спектральное ансамблирование также способно различать смесь PNPs и RENPs. Для демонстрации три микроцентрифужные тюбика заполняли растворами PNPs, RENPs и их смеси. После приобретения гиперкуба и процедуры спектрального ансамблирования карта изобилий указывает на полное присутствие PNPs в первом тюбике, RENPs во втором и смесь обоих в третьем (Рис. 5a). Реконструкция интенсивностных изображений была далее выполнена для раскрытия распределения интенсивности ФЛ сигналов PNPs и RENPs в образце (Рис. 5b).

Мы дополнительно продемонстрировали применимость нашего ГСВ метода для мультиплексирования спектрально перекрывающихся нанозондов в КВИ ФЛ визуализации ин виво. Голую мышь анестезировали и подкольно инъецировали PNPs, RENPs и их смесь. БИК визуализация с 850-нм длинноволновым фильтром показывает три неразличимых фототолюминесцентных пятна (Рис. 6a). После выполнения ГСВ и анализа карта изобилий показывает полные изобилия PNPs и RENPs в верхнем и нижнем местах инъекций соответственно, в то время как смесь обоих была идентифицирована в левом месте инъекции (Рис. 6b). Кроме того, для приобретения распределения ФЛ интенсивности выполнялась реконструкция интенсивности (Рис. 6c). Регулировка порогового значения в программном обеспечении ансамблирования до 15% (эмпирически оцененного) позволила убрать шум в областях, смежных с излучающими пятнами (Рис. 6d). Такие результаты указывают на то, что в отличие от обычной ФЛ визуализации, использующей длинноволновые или полосовые оптические фильтры, ГСВ не только способна картировать распределение интенсивности в образце, но и может мультиплексировать компоненты, присутствующие в смеси, идентифицируя спектральный профиль интенсивности в каждом пикселе изображения.

Таким образом, комбинация ГСВ приобретения и спектральной обработки ансамблирования была применена в этой работе для получения мультиплексной визуализации спектрально перекрывающихся КВИ ФЛ нанозондов. Однако следует учитывать несколько вопросов касательно применимости ГСВ модальности. Во-первых, из-за спектрально узкого приобретения каждый ГСВ кадр работает с относительно низкой интенсивностью сигнала (особенно в случае спектрально широкого ФЛ излучения от органических моетией). Кроме того, увеличение мощности лазера возбуждения ФЛ в биологической визуализации ограничено опасностью повреждения тканей (или фототоксичностью). Это приводит к более высоким требованиям к яркости ФЛ зондов и их фотостабильности, так как ГСВ может требовать на порядок больше времени приобретения по сравнению с обычной ФЛ визуализацией. Также следует отметить, что линейный анализ смесей и алгоритм спектрального ансамблирования могут удовлетворительно работать для мультиплексной ФЛ визуализации биологических тканей в спектральном диапазоне, где проницаемость тканей не меняется сильно. В противовес, если проницаемость тканей имеет выраженные особенности в спектральном диапазоне ГСВ, линейная спектральная модель смеси может быть применима с трудом (особенно в случае более глубоких тканей) и можно рассматривать нелинейные модели.

Заключение

В заключение, мы разработали технику гиперспектральной КВИ биовизуализации и применили ее для мультиплексирования наночастиц, излучающих в КВИ спектральном диапазоне. Два типа наночастиц с перекрывающимися ФЛ спектрами, которые неразличимы в обычной визуализации, были успешно мультиплексированы по их ФЛ спектральным профилям с использованием гиперспектрального приобретения вместе с алгоритмом линейного спектрального анализа смесей. Разработанный метод был успешно использован для мультиплексной визуализации КВИ ФЛ наночастиц как в суспензиях образцов, так и инъецированных в малых животных. Поскольку КВИ биовизуализация обладает превосходным разрешением на большей глубине проникновения, подход КВИ ГСВ имеет большой потенциал для использования в различных приложениях, требующих мультиплексную визуализацию с БИК-КВИ ФЛ нанозондами. Кроме того, так как КВИ биовизуализация находится на очень ранней стадии, существует огромное пространство для разработки биомедицинских применений ФЛ зондов в комбинации с ГСВ.

Доступность данных и материалов

Все данные, сгенерированные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью.

Аббревиатуры

BG:

Фон (Background)

HSI:

Гиперспектральная визуализация (Hyperspectral imaging)

LCTF:

Жидкокристаллический настраиваемый фильтр (Liquid crystal tunable filter)

NIR:

Ближний инфракрасный (Near-infrared)

NPs:

Наночастицы (Nanoparticles)

PL:

Фототолюминесценция (Photoluminescence)

PNIPAM:

Поли-N-изопропилакриламид (Poly-N-isopropylacrylamide)

PNPs:

Полимерные наночастицы (Polymeric nanoparticles)

PS:

Полистирол (Polystyrene)

RENPs:

Наночастицы, легированные редкоземельными ионами (Rare-earth doped fluoride nanoparticles)

SWIR:

Коротковолновой инфракрасный (Short-wave infrared)

TEM:

Трансмиссионная электронная микроскопия (Transmission electron microscopy)