Электрохимический биосенсор на основе нанослоев дисульфида олова для быстрого и чувствительного определения кортизола в слюне

Аннотация

Кортизол, основной гормон стресса, секретируется гипоталамо-гипофизарно-надпочечночной (ГГН) осью и служит критическим биомаркером психологического и физиологического стресса. Длительная гиперекспрессия кортизола может привести к серьезным расстройствам, таким как синдром Кушинга и болезнь Аддисона, что подчеркивает необходимость быстрого определения в точке ухода (POC). Здесь мы сообщаем о неинвазивном электрохимическом анализе слюнного кортизола на основе многослойной пленки из нанослоев дисульфида олова (SnS₂), специфического антитела к кортизолу (C-M_ab) и сывороточного альбумина грызуна (BSA), иммобилизованных на стекловистоуглеродном электроде (ГУЭ). Сенсор BSA/C-M_ab/SnS₂/ГУЭ характеризован методом электрохимической импедансной спектроскопии (ЭИС) и циклической вольтамметрии (ЦВ). Дифференциальная импульсная вольтамметрия (ДИВ) выявила линейный отклик на концентрации кортизола от 100 пМ до 100 мкМ, с пределом детектирования (LOD) 100 пМ и чувствительностью 0,0103 мА М⁻¹ см⁻² (R² = 0,9979). Измерения слюнных проб сенсором совпали с результатами ЭЛИСА в пределах 5 %, демонстрируя клиническую релевантность и специфичность. Устройство предлагает быструю, экономичную альтернативу традиционным иммуноанализам для мониторинга биомаркеров стресса.

Введение

Кортизол — стероидный гормон, выделяемый ГГН осью, наиболее широко используемый биомаркер для оценки психологического стресса. Его циркадный ритм достигает пика ранним утром и снижается к ночи, а дисрегуляция может вызвать состояния от синдрома Кушинга до болезни Аддисона. Точный мониторинг кортизола в реальном времени необходим для диагностики и управления стресс-связанными расстройствами, включая ПТСР, депрессию и расстройства аутистического спектра.

Текущие лабораторные методы — хроматография, радиоиммуноанализ, ЭЛИСА, SPR, QCM — привязаны к лаборатории, трудоемки и дороги, что ограничивает их использование в POC. Электрохимические иммуносенсоры, основанные на специфических антиген-антитело взаимодействиях, предлагают перспективное решение с простой аппаратурой, быстрым считыванием, низкой стоимостью и высокой чувствительностью. Измерение кортизола в слюне особенно привлекательно, так как оно неинвазивно и требует минимальной обработки пробы.

Хотя многочисленные наноматериалы на основе сульфидов металлов изучались для биосенсоринга, дисульфид олова (SnS₂) редко использовался как матрица для иммобилизации белков. SnS₂ — n-тип полупроводник с шириной запрещенной зоны 2,18–2,44 эВ, высокой подвижностью носителей заряда и отличной химической стабильностью, что делает его идеальной платформой для электрохимической трандукции. В этой работе мы используем двухмерные нанослои SnS₂ для построения высокочувствительного сенсора кортизола, работающего в физиологическом диапазоне концентраций.

Материалы и методы

Материалы

Гидрокортизон, анти-кортизолное антитело кролика (C-M_ab), калий гексацианоферрат (II/III), β-эстрадиол, тестостерон, прогестерон, кортикостерон и сывороточный альбумин грызуна (BSA) приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, МО). Хлорид олова(IV) пентагидрат итиоацетамид поставлены Showa (Япония) и Alfa Aesar (Великобритания) соответственно. Фосфатно-буферный раствор (PBS) и микрополированная алюмина получены от Sigma-Aldrich и Buehler (Великобритания). Все реагенты использованы без дополнительной очистки. Коммерческий набор ЭЛИСА для кортизола (Cat # SA E-6000) приобретен у LDN (Германия).

Синтез дисульфида олова

SnCl₄·5H₂O и C₂H₅NS растворили в 70 мл деионизированной воды и скорректировали pH до 7,4. Раствор перенесли в гидротермальный автоклав и нагрели до 200 °C за 1 ч, затем поддерживали 11 ч. Полученный порошок SnS₂ промыли водой и этанолом при 6000 об/мин в течение 15 мин и сушили при 80 °C на воздухе, получая однородные нанослои.

Характеризация материалов

Рентгеновская дифракция (XRD) подтвердила гексагональную фазу SnS₂ (JCPDS 89-2358). Растровое электронное микроскопирование с полевой эмиссией (FE-SEM) выявило пластинчатую морфологию с боковыми размерами ~300 нм. Передаточная электронная микроскопия (TEM) и выбранная область электронной дифракции (SAED) подтвердили монохрустальную структуру с межплоскостными расстояниями 0,167 нм и 0,316 нм; толщина нанослоев менее 10 нм.

Фабрикация биосенсоров BSA/C-M_ab/SnS₂/ГУЭ

Стекловистоуглеродные электроды (ГУЭ) полировали алюминиевой суспензией и наносили капелью дисперсию SnS₂ концентрацией 5 М. Электроды затем последовательно инкубировали с растворами C-M_ab (1 мг/мл) и BSA (1 %) в PBS. Готовые сенсоры хранили при 4 °C, когда не использовались. Концепция детекции и установка иллюстрированы на Рис. 1.

Электрохимический анализ

Электрохимическая импедансная спектроскопия (ЭИС) и циклическая вольтамметрия (ЦВ) использовались для оценки электроактивного поведения сенсора. Все измерения проводились в трехелектродной ячейке: BSA/C-M_ab/SnS₂/ГУЭ как рабочий электрод, Pt-проволока как контрэлектрод, насыщенный каломеловый электрод как референсный, в 10 мМ PBS (pH 7,4) с 5 мМ Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻. ЦВ и ДИВ сканирования выполнялись от –0,4 В до 1,0 В со скоростью 10 мВ/с.

Сбор слюнных проб и электрохимическое сенсирование

Два здоровых волонтера предоставили по 2 мл слюны в полдень. Пробы заморозили при –20 °C, разморозили, центрифугировали (3500 об/мин, 15 мин) и supernatант использовали для анализа. Измерения кортизола сенсором сравнили с результатами набора ЭЛИСА.

Исследование интерференции

Потенциальные интерференты — β-эстрадиол, тестостерон, прогестерон, кортикостерон (по 100 нМ) — тестировали путем инкубации сенсора 10 мин и измерения ЦВ отклика. Влияние на детекцию кортизола было ниже 5 %.

Определение слюнного кортизола методом ЭЛИСА

ЭЛИСА проводили по протоколу производителя. Калибровочную кривую построили по шести концентрациям кортизола (0, 0,1, 0,4, 1,7, 7,0, 30 нг/мл). Абсорбция считывали на 450 нм, полученная кривая использовалась для квантификации неизвестных проб.

Результаты и обсуждение

Материальный анализ SnS₂

XRD паттерн (Рис. 2a) соответствует гексагональной фазе SnS₂ (JCPDS 89-2358). FE-SEM изображения (Рис. 2b,c) показывают однородные пластинчатые частицы ~300 нм. TEM (Рис. 2d–f) подтверждает монохрустальные пластины с межслойными расстояниями 0,167 нм и 0,316 нм и общей толщиной ниже 10 нм.

Электрохимические отклики электрода

Добавление SnS₂ к ГУЭ значительно усилило окислительный ток (Рис. 3a,b). Последующая модификация антителом и BSA увеличила сопротивление зарядопереноса, что отразилось в данных ЭИС (Рис. 3b). ЦВ BSA/C-M_ab/SnS₂/ГУЭ при скоростях сканирования 10–100 мВ/с показало линейный рост пикового тока (Рис. 3c,d), подтверждая поверхностно-контролируемый обратимый редокс-процесс.

И ЦВ, и ДИВ продемонстрировали монотонное уменьшение пикового тока с увеличением концентрации кортизола. ДИВ дало линейную зависимость: y = –0,0103 x + 0,0443 (R² = 0,9979), с LOD 100 пМ и чувствительностью 0,0103 мА М⁻¹ см⁻². Динамический диапазон сенсора (100 пМ–100 мкМ) покрывает весь физиологический спектр слюнного кортизола.

Исследование стабильности хранения

ЦВ проводили на сенсорах, хранящихся от 1 дня до 1 недели в двух условиях: вакуумная сушка и 4 °C. Хранение при 4 °C сохраняло 91 % пикового редокс-тока после 7 дней, по сравнению с 82 % в вакууме, указывая на лучшую стабильность антителой активности при более низкой температуре.

Исследование интерференции

Инкубация с 100 нМ β-эстрадиола, тестостерона, прогестерона и кортикостерона дала <5 % изменение кортизолового сигнала (Рис. 5a), подтверждая высокую специфичность анализа.

Определение слюнного кортизола методом ЭЛИСА и электрохимическим методом

Слюнные пробы двух волонтеров дали концентрации кортизола 1,105 × 10⁻⁸ М и 3,998 × 10⁻⁹ М по ЭЛИСА, и 1,046 × 10⁻⁸ М и 3,911 × 10⁻⁹ М электрохимическим сенсором — расхождение всего 2–5 %, подтверждая точность сенсора.

Сравнение с другими исследованиями

Таблицы 2 и 3 (не показаны) сравнивают наш сенсор с незолотыми сенсорами кортизола. Преимущества настоящей работы: (1) значительно более низкая стоимость материалов; (2) быстрый, прямолинейный протокол фабрикации; (3) LOD сравнимый или лучший существующих устройств.

Заключение

Мы продемонстрировали электрохимический биосенсор на основе нанослоев дисульфида олова, обеспечивающий LOD 100 пМ и диапазон детектирования 100 пМ–100 мкМ для слюнного кортизола, соответствующий точности ЭЛИСА. Сенсор демонстрирует <5 % интерференции от структурно похожих стероидов и сохраняет >90 % активности после 7 дней при 4 °C. Его низкая стоимость, простая сборка и быстрое считывание делают его убедительным кандидатом для POC мониторинга стресса.

Доступность данных и материалов

Все данные, сгенерированные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью.

Аббревиатуры

2D:

Двумерный

BSA:

Сывороточный альбумин грызуна

C-M_ab:

Антитело к кортизолу

CV:

Циклическая вольтамметрия

DPV:

Дифференциальная импульсная вольтамметрия

EIS:

Электрохимическая импедансная спектроскопия

ELISA:

Фермент-связанный иммуносорбентный анализ

FEG-TEM:

Передаточная электронная микроскопия с полевой эмиссией

FE-SEM:

Растровое электронное микроскопирование с полевой эмиссией

GCE:

Стекловистый углеродный электрод

HPA:

Гипоталамо-гипофизарно-надпочечночная

PBS:

Фосфатно-буферный раствор

POC:

Точка ухода

PTSD:

Посттравматическое стрессовое расстройство

SAED:

Выбранная область электронной дифракции

XRD:

Рентгеновская дифракция