Электрохимический биосенсор кортизола слюны на основе нанофластов дисульфида олова

Введение

Кортизол, стероидный гормон, секретируется системой гипоталамус-гипофиз-надпочечники (HPA). Это хорошо известный биомаркер психологического стресса, поэтому его называют «гормоном стресса» [1, 2]. Уровни кортизола следуют циркадному ритму в течение 24-часового цикла; самые высокие уровни наблюдаются рано утром, а к ночи уровни постепенно снижаются [3,4,5,6]. Избыточный уровень кортизола может вызвать болезнь Кушинга с симптомами центрального ожирения, пурпурных стрий и проксимальной мышечной слабости. Однако снижение уровня кортизола может привести к болезни Аддисона с хронической усталостью, недомоганием, анорексией, постуральной гипотензией и гипогликемией [7,8,9]. Следовательно, поддержание надлежащего баланса кортизола имеет важное значение для здоровья человека.

Растет интерес к измерению уровня кортизола как предшественника важных с медицинской и психологической точек зрения событий, среди которых самым последним заболеванием является посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР). Важность аберрантной функции оси HPA при посттравматическом стрессовом расстройстве неоспорима; следовательно, традиционные методы оценки все еще могут предоставить множество доказательств и информации [10,11,12,13,14]. В последнее время во многих исследованиях сообщается о важности выявления кортизола и выявлена ​​корреляция с различными заболеваниями [15,16,17,18]. Различные исследования подтвердили, что кортизол связан с расстройством аутистического спектра [19], депрессией [20], суицидными идеями [21], невзгодами детства и экстернализирующими расстройствами [22].

Хотя определение уровней кортизола представляет собой важный диагностический инструмент, рутинные лабораторные методы определения кортизола, такие как хроматография [23, 24], радиоиммуноанализ [25], электрохемилюминесцентный иммуноанализ [26,27,28], иммуноферментный анализ [28, 29] ], поверхностный плазмонный резонанс [1, 30, 31] и микровесы на кристалле кварца [32] требуют значительного времени для анализа, являются дорогостоящими и не могут быть реализованы в условиях стационара (POC) [33]. Следовательно, в настоящее время существует потребность в точном, эффективном определении уровней кортизола в режиме реального времени.

В последние годы методы электрохимического иммуноанализа, основанные на специфическом молекулярном распознавании между антигенами и антителами, стали многообещающей технологией из-за важных характеристик, таких как использование простых устройств, экспресс-анализ, низкая стоимость, тестирование POC без меток и т.д. высокая чувствительность и низкие пороги обнаружения кортизола в биожидкостях [34, 35]. Изменения электрического потенциала приписываются изменениям концентрации электрохимических окислительно-восстановительных реакций на электроде. Секретируемый кортизол в конечном итоге попадает в систему кровообращения и может быть обнаружен в различных биожидкостях, таких как интерстициальная жидкость [36], кровь [37], моча [38], пот [39] и слюна [40]. Преимущества электрохимического определения кортизола в слюне, который представляет собой неинвазивный метод с простым сбором, обработкой и хранением образцов, расширили его возможности для применения в датчиках POC для измерения в реальном времени [41].

Идеальный биосенсор должен иметь низкие пределы обнаружения, быструю селективность и высокую чувствительность. Для изготовления иммуносенсора выбранная иммобилизирующая матрица должна обладать высокой функциональностью поверхности, высокой загрузкой биомолекул и низким сопротивлением переносу электронов с высокой скоростью переноса электронов [42]. Однако наноматериалы сульфидов металлов редко предлагались для иммобилизации белков для электрохимического биосенсинга. Поэтому здесь дисульфид олова был выбран в качестве потенциальной иммобилизирующей матрицы для разработки иммуносенсоров с целью обнаружения кортизола в слюне.

В последнее десятилетие нано-двумерные (2D) материалы привлекли множество исследовательских интересов. Существует множество видов 2D-материалов, от полупроводников до металлов и от неорганических до органических [43,44,45,46] и родственных композитов [47,48,49,50]. Открытие, производство и исследование наноразмерных 2D-материалов являются преобладающими потоками в различных областях. Нано-2D дисульфид олова (SnS ₂ ), полупроводник n-типа с шириной запрещенной зоны 2,18–2,44 эВ [51, 52], состоит из атомов Sn, зажатых между двумя слоями гексагонально расположенных и близко расположенных атомов серы (S), при этом соседние слои S связаны слабым ван-дер Силы Ваальса [53]. Благодаря своим удивительным электрическим свойствам, высокой подвижности носителей, хорошей химической стабильности, низкой стоимости и оптическим свойствам [54] SnS ₂ превратился в многообещающий материал для различных применений в солнечных элементах и ​​оптоэлектронных устройствах [55, 56], в качестве электродов в литий-ионных батареях [57, 58], газовых сенсорах и мониторах глюкозы [59, 60]. Выбор материала электрода является важным ключевым фактором для улучшения характеристик за счет обеспечения большой площади реакции и благоприятного микросреда для облегчения переноса электронов между ферментом и поверхностью электрода.

В этой работе биосенсоры были изготовлены с использованием SnS ₂ как иммобилизирующая матрица для обнаружения кортизола. Результаты исследований дифференциальной импульсной вольтамперометрии (DPV), связанных с электрохимическим зондированием, показывают высокую чувствительность 0,0103 мА / млн см ² и самая низкая концентрация обнаружения 100 пМ.

Материалы и методы

Материалы

Гидрокортизон (кортизол), антитела против кроличьего кортизола (анти-кортизол, C-M _ab ), гексацианоферрат калия (II), гексацианоферрат калия (III), β-эстрадиол, тестостерон, прогестерон и кортикостерон были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Бычий сывороточный альбумин (BSA) был получен от PanReac. Пентагидрат хлорида олова (IV) (SnCl ₄ ^. 5H ₂ O) и тиоацетамид (C ₂ H ₅ NS) поставлялись компаниями Showa (Япония) и Alfa Aesar (Великобритания). Солевой раствор с фосфатным буфером (PBS), приготовленный с NaCl, KCl, Na ₂ HPO ₄ , и KH ₂ ЗП ₄ были приобретены у Sigma-Aldrich. Микрополированный оксид алюминия был получен от Buehler (Великобритания). Все остальные химические вещества были аналитической чистоты и использовались без дополнительной очистки. Набор для ИФА слюны кортизола (№ по каталогу SA E-6000) был приобретен у LDN (Германия).

Синтез дисульфида олова

Порошки SnCl ₄ · 5H ₂ O и C ₂ H ₅ NS смешивали в 70 мл деионизированной воды и доводили pH до 7,4. Реактор-гидротермальный автоклав, содержащий реагенты, нагревали от комнатной температуры до 200 ^° . C в течение 1 ч и выдерживается на уровне 200 ^° C в течение 11 ч. Затем полученный SnS ₂ порошок промывали деионизированной водой и этанолом при 6000 об / мин в течение 15 мин и окончательно сушили на воздухе при 80 ^° . C. Этот гидротермальный метод был успешно применен для синтеза SnS ₂ .

Характеристики материалов

Рентгеновская дифракция (XRD, PANalytical, Нидерланды) была использована для исследования кристаллической фазы 2D гексагонального SnS ₂ хлопья. Многофункциональная автоэмиссионная сканирующая электронная микроскопия (FE-SEM, Zeiss, Германия) использовалась для изображения морфологии поверхности материалов. Просвечивающая электронная микроскопия с автоэмиссионной пушкой (FEG-TEM, Tecnai, США) была использована для определения микроструктуры SnS ₂ , и дифракция на выбранной площади (SAED, Tecnai) использовалась для получения кристаллических структур.

Изготовление BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE Биосенсоры

Стеклоуглеродные электроды (GCE) сначала полировали суспензией оксида алюминия, а затем каплями смеси 5 M SnS ₂ были нанесены на поверхность предварительно обработанных GCE. Растворы антител против кортизола (1 мг / мл) и BSA (1%) готовили в PBS. SnS ₂ / GCE затем последовательно декорировали растворами антитела и BSA. Изготовленный BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Биосенсоры GCE хранили в холодильнике при 4 ^° C, когда не используется. Концепция исследования и настройка системы обнаружения показаны на рис. 1.

Концепция исследования и настройка системы обнаружения

Электрохимический анализ

Изготовлен из BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCEs были охарактеризованы с помощью спектроскопии электрохимического импеданса (EIS) и циклической вольтамперометрии (CV) для сравнения их электроактивного поведения. Исследования электрохимического ответа в зависимости от концентрации кортизола проводились с использованием CV и дифференциальной импульсной вольтамперометрии (DPV). Все эксперименты проводились с использованием трехэлектродной системы с GCE в качестве рабочего электрода, Pt-проволоки в качестве вспомогательного электрода и насыщенного каломельного электрода в качестве электрода сравнения в 10 мМ PBS (pH 7,4), содержащем 5 мМ Fe (CN ) ₆ ^{3- / 4-} . Электрохимические измерения проводили на электрохимической станции серии CHI6114E (CH Instruments, США). Измерения CV и DPV проводились в диапазоне от –0,4 В до 1,0 В при скорости сканирования 10 мВ / с, если не указано иное.

Сбор образцов слюны и электрохимическое зондирование

Примерно в полдень у двух здоровых добровольцев был взят образец слюны (2 мл) для проверки разработанного BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE. Образцы слюны получали без фильтрации и первоначально хранили при -20 ° C для сохранения биологических характеристик. Перед зондированием образцы слюны оттаивали до комнатной температуры и центрифугировали при 3500 об / мин в течение 15 минут, чтобы собрать супернатант для измерения. Отделенную слюну хранили при -20 ° C. BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE использовался для электрохимического определения концентрации кортизола в образцах слюны. Обнаружение кортизола с помощью электрохимического анализа с BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE сравнивали с коммерчески доступным набором кортизола для ELISA, упомянутым выше.

Исследование помех

Ингибирующее действие потенциальных мешающих агентов, таких как другие стероидные гормоны, на BSA / C-M _ab / SnS ₂ Специфичность / GCE исследовали, помещая биосенсор в следующие различные растворы:100 нМ β-эстрадиола, 100 нМ тестостерона, 100 нМ прогестерона и 100 нМ кортикостерона на 10 мин, а затем сканировали с помощью CV. Скорость сканирования составляла 10 мВ / с, а диапазон сканирования - от -0,4 В до 0,6 В.

Обнаружение кортизола в слюне с помощью ELISA

ELISA проводился на образцах слюны в соответствии с протоколом производителя. Чтобы построить калибровочную кривую для измерений кортизола, анализ выполняли в 96-луночном титровальном планшете, содержащем шесть известных стандартных концентраций кортизола (0,0, 0,1, 0,4, 1,7, 7,0 и 30 нг / мл) для определения оптической плотности каждой лунки. при 450 нм. Калибровочная кривая была дополнена линией тренда, чтобы получить уравнение для расчета неизвестных образцов.

Результаты и обсуждение

Анализ материалов SnS ₂

Как видно из рентгенограммы на фиг. 2a, синтезированный продукт отображает только пики XRD, соответствующие гексагональной фазе SnS ₂ (Карта JCPDS № 89-2358). На рис. 2b, c показаны изображения FE-SEM синтезированного SnS ₂ . имеющий однородную чешуйчатую морфологию размером примерно 300 нм. На рис. 2d – f показаны изображения SnS ₂ , полученные методом FEG-TEM и SAED. , в которой интервалы решеток 0,167 нм и 0,316 нм определены для гексагонального SnS ₂ как единая кристаллическая структура. Укладка нанофластов составляет менее 10 слоев с общей толщиной менее 10 нм.

а Рентгенограмма SnS ₂ . FE-SEM изображения SnS ₂ нано-чешуйки были получены при увеличении ( b ) × 250 000 и ( c ) × 100000. г ФЭГ-ПЭМ изображения SnS ₂ нанофлейки. е Поперечное сечение FEG-TEM SnS ₂ нано-хлопья и увеличенное изображение ФЭГ-ТЕМ. е SAED изображение SnS ₂ нанофлейки

Электрохимические реакции электрода

Ток окисления может значительно увеличиться при добавлении дисульфида олова. Как показано на рис. 3a, b, величина тока окисления уменьшилась с SnS ₂ / GCE в C-M _ab / SnS ₂ / GCE, за которым следует BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE, по мере увеличения значения сопротивления переносу заряда. Таким образом, результаты показывают, что свойства сенсора на электроде были изменены. Изначально BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE исследовали путем изменения скорости сканирования от 10 мВ / с до 100 мВ / с, как показано на рис. 3c. Изменение отклика тока в зависимости от скорости сканирования, как показано на рис. 3d, показывает, что ток окисления увеличивается линейно с увеличением скорости сканирования и подчиняется соотношению: I =0,5156 υ – 0,0319 ( R ² =0,9985) при окислении и I =0,6758 – 0,0288 ( R ² =0,9997) в уменьшении. Однако почти линейность приращения пикового тока с увеличением скорости сканирования с четко определенными пиками окислительно-восстановительного потенциала указывает на контролируемый поверхностью процесс со стабильным переносом электронов.

а Исследование ВАХ электрода GCE (кривая а), SnS ₂ / Электрод GCE (кривая b), C-M _ab / SnS ₂ / Электрод GCE (кривая c), BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Электрод ГЦЭ (кривая г). б Исследование реакции EIS на GCE, SnS ₂ / GCE, C-M _ab / SnS ₂ / GCE и BSA / C-M _ab / SnS ₂ Электроды ГЦЭ. На вставке:соответствующая эквивалентная схема. c Повышенная величина тока реакции окисления BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Электрод GCE с увеличенной скоростью сканирования от 10 мВ / с до 100 мВ / с. г Текущая величина увеличивалась с увеличением скорости сканирования. е CV исследования BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Электрод GCE в зависимости от концентрации кортизола от 100 до 100 мкМ. е Кривая линейности текущего ответа при различных концентрациях кортизола. г DPV исследования BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Электрод GCE в зависимости от концентрации кортизола от 100 до 100 мкМ. ч Кривая линейности для текущего ответа при различных концентрациях кортизола

Ток уменьшался с увеличением концентрации кортизола в диапазоне от 100 пМ до 100 мкМ. Разница в силе тока напрямую связана с измеряемой концентрацией кортизола. Текущие значения и хорошо разделенные пики окисления были получены для BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Электроды ГЦЭ, как показано на рис. 3д, ф. Изменение тока с логарифмом концентрации было почти линейным. Понятно, что уменьшение коэффициента линейной регрессии лучше для CV. Поэтому дальнейшие измерения были выполнены с более конкретным и точным DPV. Результаты таких исследований DPV показали, что величина текущего ответа уменьшалась при добавлении кортизола, как показано на рис. 3g. Калибровочная кривая, представленная на рис. 3h, отображает величину текущей реакции и логарифм концентрации кортизола, и было обнаружено, что она линейно зависит и соответствует уравнению: y =- 0,0103 x + 0,0443; R ² =0,9979. Этот датчик имел диапазон обнаружения от 100 до 100 мкМ, с пределом обнаружения 100 пМ и чувствительностью 0,0103 мА / млн см ² ( R ² =0,9979).

Исследование стабильности хранилища

CV-исследования также были проведены для изучения срока годности BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE с интервалом от 1 дня до 1 недели. Чтобы сравнить два условия хранения, одно условие заключалось в хранении электродов в высушенном состоянии под вакуумом, а другое - при хранении электродов при 4 ° C. Стабильность пиков окислительно-восстановительного потенциала электродов при 4 ° C и в вакууме показана на рис. 4a, c соответственно. Понятно, что условия хранения при 4 ° C были лучше, чем в вакууме. На рис. 4b, d показано, что значение стабильности электрода составляло 82% при хранении электродов в вакууме в течение 7 дней, в то время как значение стабильности электрода составляло 91% при хранении электродов при 4 ° C. Можно заметить, что стабильность электродов, хранящихся при 4 ° C, была выше, чем в вакууме. Потеря активности электрода, возможно, была вызвана деградацией активности антител к кортизолу в вакууме. Стабильность при хранении является решающим фактором для ферментативного сенсора. Защитное покрытие может быть введено в будущую конструкцию электрода.

Стабильность пиков окислительно-восстановительного потенциала BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Электрод GCE с разными условиями консервации ( a и b ) под вакуумом ( c и d ) при 4 ° C в течение 7 дней

Исследование помех

Результаты CV исследований BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE для измерения потенциальных мешающих факторов, таких как β-эстрадиол (100 нМ), тестостерон (100 нМ), прогестерон (100 нМ) и кортикостерон (100 нМ) по отношению к кортизолу (10 нМ), показаны на рис. 5а. По сравнению с изменением реакции сигнала кортизола, влияние интерференции составило менее 5% от результата для кортизола, что позволяет предположить, что такими потенциальными помехами можно легко пренебречь.

а Исследование интерференции с участием β-эстрадиола (100 нМ), тестостерона (100 нМ), прогестерона (100 нМ) и кортикостерона (100 нМ) по отношению к кортизолу (10 нМ). б Сравнение результатов измерения кортизола в слюне с помощью ELISA и электрохимических методов

Обнаружение кортизола в слюне с помощью ELISA и электрохимических методов

Измерения образцов кортизола в слюне, выполненные с помощью ELISA и BSA / C-M _ab / SnS ₂ Электроды / GCE приведены в Таблице 1 и на Рис. 5b. Концентрации кортизола, определенные с помощью ELISA, составляли 1,105 × 10 ^-8 . M и 3.998 × 10 ⁻⁹ М. Результаты расчета кортизола с использованием электрохимических измерений:1,046 × 10 ^-8 M и 3.911 × 10 ⁻⁹ М. С помощью этих двух методов была достигнута хорошая корреляция, показывающая сопоставимые результаты с разницей всего в 2–5%. Следовательно, результаты демонстрируют, что этот BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE можно использовать для электрохимического определения кортизола в биологически значимых жидкостях, таких как слюна.

Сравнение с другими исследованиями

Результаты этого исследования сравнивались с другими исследованиями с участием электрохимических датчиков кортизола слюны, о которых сообщалось в литературе, чтобы лучше понять эффективность этого BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE. Таблицы 2 и 3 показывают сравнение результатов, полученных с использованием не-золотых электродов при обнаружении кортизола. Есть три основных преимущества данной работы. Во-первых, материалы намного дешевле устройств, представленных в других исследованиях. Во-вторых, процесс подготовки был относительно простым и быстрым. Наконец, предел обнаружения был аналогичен тому, о котором сообщалось в другой литературе, или даже лучше, чем указанный, в то время как целевой диапазон обнаружения кортизола слюны легко получить.

Выводы

Для синтеза SnS ₂ успешно применен гидротермальный метод. . Свойства SnS ₂ были охарактеризованы с помощью XRD, FE-SEM, FEG-TEM и SAED. Электрохимические реакции электрода в зависимости от концентраций кортизола определяли с использованием CV и DPV. Наш датчик кортизола показал диапазон обнаружения от 100 пМ до 100 мкМ, предел обнаружения 100 пМ и чувствительность 0,0103 мА / мкм ² ( R ² =0,9979). Полученные параметры зондирования находились в нормальных физиологических диапазонах. Влияние потенциальных помех было менее 5%, что указывает на хорошую специфичность этого датчика. Тестирование стабильности показало, что активность датчика, хранящегося при 4 ° C, была лучше, чем в вакууме. Результаты этого электрода для измерения кортизола в образцах слюны соответствовали ELISA. Следовательно, электрохимический анализ с использованием этого BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Электрод GCE может заменить более традиционные трудоемкие методы иммуноанализа.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью.

Сокращения

2D:

Двумерный

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

C – M _ab :

Антитела к кортизолу

Резюме:

Циклическая вольтамперометрия

DPV:

Дифференциальная импульсная вольтамперометрия

EIS:

Электрохимическая импедансная спектроскопия

ELISA:

Иммуноферментный анализ

FEG-TEM:

Просвечивающий электронный микроскоп автоэмиссионной пушки

FE-SEM:

Сканирующий электронный микроскоп с автоэмиссией

GCE:

Электроды из стеклоуглерода

HPA:

Гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковый

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

POC:

Пункт обслуживания

PTSD:

Посттравматическое стрессовое расстройство

SAED:

Дифракция в выбранной области

XRD:

Рентгеновская дифракция