Функционализация поверхности APTES-GLU повышает чувствительность ELISA для детекции HIV-p24 до 1 нМ

Аннотация

Иммуноферментный анализ (ELISA) остается золотым стандартом скрининга заболеваний, однако его чувствительность во многом зависит от эффективности иммобилизации антигенов на полистироловых (PS) пластинках. Мы разработали простую, воспроизводимую химию модификации поверхности с использованием 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES) с последующим перекрестным связыванию глутаральдегидом (GLU), что обеспечивает высокоплотный, ориентированный белковый слой. После активации PS 1% KOH, соотношение 1% APTES и 1% GLU дало наиболее сильный сигнал, аovernight-инкубация с GLU максимизировала связывание. Используя эту платформу, мы детектировали HIV-p24 — маркер ранней инфекции — при концентрации 1 нМ, что в 30 раз ниже, чем при конвенциональном ELISA. Модифицированная поверхность также продемонстрировала отличную специфичность по отношению к человеческой сыворотке и HIV-TAT. Данная химия легко переносима на другие биомаркерные анализы, требующие повышенной эффективности захвата.

Введение

Точное обнаружение биомаркеров заболеваний, включая вирусные антигены, критически важно для ранней диагностики и управления пациентами. Популярность ELISA обусловлена его высокой чувствительностью и простотой использования, однако его производительность может быть ограничена субоптимальным присоединением антигенов к поверхности PS. Конвенциональная адсорбция опирается на электростатические взаимодействия между поверхностными карбоксилами и аминовыми группами белков, что может привести к неравномерному покрытию и снижению ориентации. Были изучены многочисленные стратегии — фотохимия, полимерные покрытия (например, PVLA) и ПЭГилирование — для улучшения иммобилизации, но многие из них по-прежнему сталкиваются с трудностями при работе с малыми белками или пептидами.

Гидрофобная основа полистирола предлагает ограниченные возможности для ковалентного присоединения. APTES вводит первичные амины, позволяя дальнейшую функционализацию бифункциональными перекрестными связующими агентами, такими как GLU, обладающим двумя альдегидными группами. Этот подход ковалентно анкорирует белки через образование базовых оснований Шиффа, способствуя формированию более плотного и равномерного слоя. Предыдущие работы показывали, что химия APTES-GLU может усилить захват антител на золоте или силице, но её применение на ELISA-пластинках для детекции малых антигенов не было полностью продемонстрировано.

HIV-p24 — это ядерный капсидный белок, высвобождающийся на ранних стадиях инфекции, что делает его идеальной мишенью для чувствительных анализов. Здесь мы применили химию модификации поверхности APTES-GLU для достижения ультрачувствительного детектирования p24, установив новый эталон для диагностики на базе ELISA.

Материалы и методы

Реактивы и биомолекулы

Рекомбинантные белки HIV-p24 и Tat, а также анти-p24 антитело получены от Abcam (Малайзия). APTES, GLU и человеческая сыворотка приобретены у Sigma-Aldrich (США). Анти-мышиное-IgG-HRP получено от Thermo Scientific (США). ELISA-пластинки — от Becton Dickinson (Франция), 5× coating buffer — от Biolegend (Великобритания). BSA и субстрат TMB — от Promega (США). Анализатор ELISA поставлен Fisher Scientific (Малайзия).

Оптимизация соотношений APTES и GLU

После активации PS 1% KOH в течение 10 минут, мы тестировали APTES в концентрациях 0,5%, 1% и 2% (объем/объем) overnight при комнатной температуре. Последующие обработки GLU в концентрациях 1% и 2% применялись к модифицированным поверхностям. Затем инкубировали фиксированную концентрацию 250 нМ HIV-p24 на каждой поверхности, блокировали 2% BSA. Добавили анти-p24 антитело в разбавлении 1:1000 и анти-мышиное-IgG-HRP, реакцию визуализировали с TMB и измерили оптическую плотность при 405 нм. Контроли проводились без целевого антигена.

Время инкубации с GLU

Для оценки влияния времени воздействия GLU, поверхности инкубировали с GLU либо 3 часа, либо overnight перед добавлением 250 нМ HIV-p24. Остальные этапы повторяли предыдущий протокол.

Сравнение стратегий детекции

Мы сравнили два GLU-медированных подхода: (1) «амин-GLU-p24», где GLU-модифицированный PS непосредственно контактировал с 100 нМ p24, и (2) «амин-GLU премикс», где GLU (2%) смешивали с 100 нМ p24 на 30 минут при комнатной температуре перед адсорбцией на APTES-модифицированную пластинку. Детекция проводилась той же последовательностью инкубации с антителами.

Оценка предела детекции

Подготовили серийные разбавления p24 (0,5–500 нМ). Для каждой разбавки выполняли конвенциональный ELISA и два метода APTES-GLU (1 и 2). Оптические плотности при 405 нм записывали после стандартных этапов промывания.

Тестирование специфичности

Для проверки специфичности анализа, человеческую сыворотку и белок HIV-TAT (смешанный с 1% GLU) тестировали в идентичных условиях вместо p24. Значимого сигнала по сравнению с положительным контролем p24 не наблюдалось.

Результаты и обсуждение

Модификация поверхности через активацию KOH, аминирование APTES и перекрестное связывание GLU создает химически надежную платформу для захвата белков. Рисунок 1а иллюстрирует последовательность: активация KOH → APTES → GLU → иммобилизация антигена → антигенное детектирование.

При оптимизации концентраций APTES/GLU, 1% каждого дало наивысший специфический сигнал (OD ≈ 0,22) с минимальным фоном (OD ≈ 0,08). Более высокие концентрации (2%) увеличивали неспецифическое связывание, вероятно, из-за избытка альдегидных групп, взаимодействующих с другими поверхностными сайтами. Overnight-инкубация с GLU дала примерно удвоенный OD по сравнению с 3-часовым воздействием, указывая на более полное покрытие поверхности (Рисунок 4а).

При сравнении двух GLU-стратегий, подход с premiксом (метод 2) последовательно давал более высокие значения OD по всем концентрациям, подчеркивая преимущество предварительного связывания GLU с антигеном перед адсорбцией на пластинку.

Конвенциональный ELISA достиг предела детекции (LOD) 30 нМ. Метод 1 снизил LOD до 4 нМ — улучшение в 7,5 раз, тогда как метод 2 достиг впечатляющего LOD 1 нМ, что составляет 30-кратное улучшение. Этот драматический прирост чувствительности atribuируется более высокой плотности белка и оптимальной ориентации, обеспечиваемым химией APTES-GLU.

Анализы специфичности подтвердили, что ни человеческая сыворотка, ни HIV-TAT не дают значимых сигналов, подчеркивая селективность анализа к p24.

Заключение

Оптимизированная ковалентная иммобилизация антигенов на PS ELISA-пластинках через APTES и GLU существенно улучшает пределы детекции. Обеспечивая плотный, ориентированный белковый слой, данная химия поверхности достигает 30-кратно более низкого LOD для HIV-p24, иллюстрируя свой потенциал для других малобольных биомаркеров. Метод прост, масштабируем и совместим с существующими рабочими процессами ELISA, открывая путь к более чувствительным, клинически релевантным диагностическим подходам.

Аббревиатуры

APTES:

3-(Аминопропил)триэтоксисилан

BSA:

Бовсиновый сывороточный альбумин

COOH:

Карбоксил

ELISA:

Иммуноферментный анализ

Fc:

Фрагмент кристаллизуемый

GLU:

Глутаральдегид

HIV:

Вирус иммунодефицита человека

HRP:

Хреновидная пероксидаза

IgG:

Иммуноглобулин

OD:

Оптическая плотность

PEG:

Полиэтиленгликоль

PS:

Полистирол

PVLA:

Поливинилбензиллактонамид

TMB:

3,3′,5,5′-Тетраметилбензидин