Система обратимой сборки, индуцированная pH, с контролируемой загрузкой и высвобождением ресвератрола для улучшенной химиотерапии, направленной на опухоль

Введение

Рак легкого - одно из самых смертоносных солидных злокачественных новообразований человека. С усилением ухудшения окружающей среды и других факторов заболеваемость раком легких увеличивается год от года, а его 5-летняя выживаемость составляет всего 17,4% [1, 2]. В настоящее время, хотя доступны традиционные клинические методы лечения, такие как хирургическая резекция, лучевая терапия и стандартная химиотерапия первой линии, средний уровень общей выживаемости пациентов с раком легкого все еще нуждается в улучшении [3, 4]. Поэтому срочно необходимо разработать более эффективные и безопасные методы лечения этого смертельного заболевания. В настоящее время, хотя низкие целевые эффекты и высокие побочные эффекты многих химиотерапевтических препаратов ограничивают их применение в химиотерапии [5, 6], постоянно разрабатываются новые химиотерапевтические агенты, особенно в развивающейся области нанолекарств [7,8, 9,10]. Ресвератрол (RV) - это экстракт натуральных растений, таких как виноград и соевые бобы, который широко используется в клинических условиях для стимуляции агрегации тромбоцитов, ингибирования вазодилатации, снижения вязкости крови и т.п. [11,12,13,14,15 ]. В последние годы было обнаружено, что он обладает сильным противораковым действием [16,17,18]. Однако, как потенциальное низкомолекулярное лекарство, РВ также имеет некоторые недостатки, как и другие химиотерапевтические препараты первого ряда, такие как плохая растворимость, короткий период полувыведения из кровообращения и недостаточная селективность опухоли [19, 20]. В последние годы были разработаны нанопрепараты на основе RV для преодоления этих недостатков и усиления терапевтических эффектов [21]. Для загрузки ПЖ использовались различные виды наноносителей, включая липосомы, сывороточный альбумин, углеродные материалы, двумерные дихалькогениды переходных металлов (2D-TMD) и другие [21,22,23,24,25]. Хотя сообщалось, что эти наноносители эффективно усиливают терапевтические эффекты RV, они все же демонстрируют некоторые недостатки, такие как высокоэффективная активная способность к высвобождению триггера для липосом и сывороточного альбумина, а также потенциальная долгосрочная системная токсичность для углеродных материалов и 2D- ДВНЧС [26, 27]. Следовательно, все еще существует потребность в более квалифицированных наноносителях.

Ферритин - это природный белок наноклетки с просветом примерно 8 нм, образованный в результате взаимодействия и сборки 24 субъединиц тяжелой и легкой цепей [28, 29]. Поскольку ферритин является эндогенным белком, он обладает превосходной биосовместимостью и безопасностью. Кроме того, есть сообщение о том, что ферритин является природным pH-чувствительным белком, который может быть обратимо денатурирован и повторно собран при изменении его среды с кислой на щелочную [30]. Когда pH был кислым, разобранные стержневидные олигомеры восстанавливались только до структуры в форме гарнитуры, а разобранные промежуточные соединения в форме гарнитуры восстанавливались только до полой сферической структуры [28,29,30]. Это уникальное поведение при сборке и разборке, обусловленное pH, делает ферритин идеальной системой доставки лекарств. Недавно Zhang et al. сообщили, что молекулы доксорубицина (DOX) могут быть инкапсулированы в ферритин и успешно высвобождены путем регулирования pH для терапии опухолей [28].

В этом исследовании мы стремились разработать основанную на ферритине pH-индуцированную систему обратимой сборки (PIRAS) для контроля нагрузки и высвобождения правого желудочка для усиленной химиотерапии, направленной на опухоль. Поверхность ферритиновой сферы была связана с нацеленным на опухоль пептидом RGD. Полученное в результате нанолекарство RV @ Ft-RGD продемонстрировало стабильность в нейтральной и щелочной среде (pH> 7,4) и высвобождает RV только в кислой среде (pH <7,4). При дальнейшем описании RV @ Ft-RGD продемонстрировал следующие преимущества in vitro и in vivo:(1) RV @ Ft-RGD нацелены на опухолевые клетки и накапливаются в лизосомах (кислая среда), где способствует высвобождению большего количества RV в цитоплазму.; (2) носитель ферритина значительно увеличивал период полувыведения свободного ПЖ в крови, улучшая удержание лекарственного средства в системном кровотоке, чтобы облегчить накопление лекарств в участках опухоли; (3) архитектурная стабильность ферритина предотвращала утечку разрыва RV в процессе доставки; (4) RV @ Ft-RGD продемонстрировал отличную биосовместимость in vitro и in vivo. Таким образом, благодаря этим достоинствам RV @ Ft-RGD проявил великолепные противоопухолевые терапевтические свойства, которые показывают большой потенциал для будущих клинических переводов.

Материалы и методы

Материалы

Ферритин, ресвератрол (RV, ≥ 99%) были от Sigma-Aldrich. 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC), N-гидроксисукцинимид (NHS) и флуоресцеинизотиоцианат (FITC) были приобретены у Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD (Шанхай, Китай). NH ₂ -ПЭГ ₂₀₀₀ -RGD был приобретен у Hunan Huateng Pharmaceutical Co., Ltd (Хунань, Китай). Среда для клеток DMEM, фетальная бычья сыворотка (FBS) и фосфатно-солевой буфер (PBS) были получены от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США). Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) был предоставлен Dojindo Laboratories (Япония).

Синтез RV @ Ft-RGD

Загрузка RV была подготовлена, как описано в предыдущем отчете [21, 28] с изменениями. Во-первых, NH ₂ -ПЭГ ₂₀₀₀ -RGD (10 мг) диспергировали в растворе Ft (1,5 мг / мл) в присутствии 20 мкл EDC (5 мг / мл) и 20 мкл NHS (20 мг / мл). Смесь реагировала в течение 2 ч при 4 ° С при легком перемешивании и очищалась диализом против дистиллированной воды (пороговая молекулярная масса =5 кДа) в течение ночи, в результате чего получали наночастицы Ft-RGD. Затем нерастворимый в воде RV растворяли в ДМСО до концентрации 2 мг / мл и добавляли в раствор Ft-RGD с конечной концентрацией 1,5 мг / мл. PH смеси доводили до pH =5, чтобы разобрать полипептидные субъединицы. После этого pH смеси медленно доводили до 7,4 с помощью гидроксида натрия (1 M), чтобы он напоминал субъединицы полипептида. Полученный раствор диализовали в дистиллированной воде в течение ночи для удаления свободных молекул RV, которые должны быть конечным продуктом (RV @ Ft-RGD). Количество загруженного RV определяли с помощью спектрофотометра UV-vis (UV3100, Shimadzu, Japan) путем отслеживания пика поглощения при 306 нм. Коэффициент загрузки RV был ( A _а - А _b ) / А _c , где A _а , А _b , и A _c представляют собой вес исходного, незагруженного RV и Ft-RGD, соответственно.

Характеристики

Метод динамического рассеяния света (DLS) (BI-9000AT, Brookhaven, USA) использовался для определения размера и дзета-потенциала наночастиц. Морфологию наночастиц наблюдали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ, JEM-100S, JEOL, Япония). Спектры флуоресценции регистрировали на люминесцентном спектрофотометре Perkin-Elmer LS50B. Сигнал клеточной флуоресценции регистрировали с помощью коммерческого лазерного сканирующего микроскопа (LSM 510, Zeiss, Германия) и проточной цитометрии (FCM, EPICS XL, Beckman, США).

Исследование выпуска RV

Пятьсот микролитров раствора RV @ Ft-RGD помещали в D-пробирку (MWCO 6–8 кДа, Novagen), и раствор доводили до различных значений pH с помощью разных буферов. Затем раствор диализовали при 37 ^o . После другого времени инкубации аликвоты диализата по 1 мл были удалены и заменены 1 мл свежей среды. RV, высвобождаемый в разное время инкубации, определяли с помощью спектрофотометра УФ-видимой области. Кроме того, RV @ Ft-RGD растворяли в промывочном растворе, имеющем различные условия pH, включая pH 5, 6,5, 7,4 и 8,5. После инкубации при 37 ° C в течение 24 часов размер наночастиц был охарактеризован методом DLS.

Культура клеток

Клетки рака легких человека A549 и NCI-H358 были получены из коллекции клеток Китайской академии наук (Шанхай, Китай) и культивированы в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин (PS) в увлажненная атмосфера, содержащая 5% CO ₂ в 37 ^o С.

Использование сотовой связи и локализация RV @ Ft-RGD

В качестве часто используемого метода для маркировки наночастиц применялся FITC. FITC растворяли в растворе этанола (2,0 мг / мл) и смешивали с водным раствором RV @ Ft и RV @ Ft-RGD (1,0 мг / мл) при 4-часовом перемешивании в темноте при комнатной температуре. Смесь диализовали в дистиллированной воде в течение ночи для удаления избыточного FITC и этанола, в результате чего получали раствор RV @ Ft и RV @ Ft-RGD, меченный FITC. Чтобы подтвердить локализацию наночастиц в органеллах in vitro, клетки обрабатывали FITC-меченными RV @ Ft и RV @ Ft-RGD в течение 5 часов и окрашивали лизосомно-специфическим красителем Lyso Tracker Red (Invitrogen). После этого с помощью CLSM наблюдали клеточную интернализацию RV @ Ft и RV @ Ft-RGD. Вкратце, клетки A549 инкубировали с меченными FITC RV @ Ft и RV @ Ft-RGD (с такой же концентрацией FITC) в течение 5 часов. Затем клетки обрабатывали растворами Lyso Tracker Red (100 нМ) при 37 ° C в течение 30 мин. После трехкратной промывки PBS клетки наблюдали с помощью коммерческого лазерного сканирующего микроскопа. Программное обеспечение ImageJ использовалось для анализа интенсивности флуоресценции клеток.

Исследование химиотерапии опухолей и апоптоза in vitro

Прежде всего, цитотоксичность носителя Ft-RGD оценивали с помощью стандартного анализа CCK-8 (Bestbio, Китай). Ячейки A549 и NCI-H358 (1 × 10 ⁵ клеток / мл, 0,5 мл) высевали в 96-луночный планшет и культивировали в течение 24 часов. После удаления старых сред свежие среды, содержащие 0, 0,01, 0,1, 0,5 и 1 мг / мл Ft-RGD, инкубировали с клетками A549 и NCI-H358 в течение 24 часов. Клетки осторожно промывали трижды PBS. Затем в каждую лунку добавляли сто микролитров рабочего раствора CCK-8 (10% CCK-8 + 90% DMEM) и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° C. Значения поглощения при 450 нм измеряли с помощью спектрофотометра для микропланшетов (Multiskan FC, Thermo Scientific). Фотографии каждой группы клеток наблюдали с помощью оптического микроскопа (Olympus).

Различные концентрации свободных RV, RV @ Ft, RV @ Ft-RGD и RV @ Ft-RGD + RGD (0, 10, 20, 30 и 40 мкг / мл эквивалентов RV) обрабатывали клетками A549. После 24 ч инкубации жизнеспособность обработанных клеток анализировали с помощью анализа CCK-8. Между тем, эти обработанные клетки были дважды окрашены набором для обнаружения апоптоза (аннексин VFITC / PI) и проанализированы с помощью FCM.

Время циркуляции RV @ Ft-RGD в крови

Свободный ПЖ или ПЖ @ Ft-RGD (эквивалент 6 мг / кг ПЖ) вводили внутривенно здоровым голым мышам Balb / c ( n =5 на группу). После инъекции венозную кровь мышей собирали в разные моменты времени и помещали в пробирку для сбора крови, содержащую гепарин, а затем отделяли плазму. Концентрацию правого желудочка в плазме определяли подкисленным изопропанольным реагентом, а затем измеряли его поглощение при возбуждении 306 нм для определения концентрации правого желудочка.

Модель на животных и in vivo Химиотерапия опухолей

Мыши Balb / c (возраст 4-6 недель), использованные в этой работе, были приобретены в Charles River Laboratories (Пекин, Китай). Все операции, связанные с экспериментами на животных, строго соответствуют инструкциям по уходу и использованию лабораторных животных. Руководство было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Чжэнчжоу. Чтобы создать модель подкожной опухоли A549, 2 × 10 ⁶ Клетки A549 вводили подкожно в спину мышей. Затем их поместили в птичник на 7-9 дней. Формула расчета объема опухоли:длина × ширина ² / 2.

Опухоли A459 мышей случайным образом разделили на пять групп. Каждая группа состояла из пяти мышей. Конкретными группами являются контроль (физиологический раствор), RV, RV @Ft и RV @ Ft-RGD. В начале лечения образец вводили один раз в день через хвостовую вену в течение трех дней подряд. Объем опухоли и массу тела мышей регистрировали каждые 5 дней. После 45 дней лечения собирали опухоли каждой группы. Ткани опухоли фиксировали в 10% растворе формалина, делали срезы и затем окрашивали гематоксилином и эозином (H&E).

Биосовместимость in vivo

Двести микролитров RV @ Ft-RGD вводили здоровым мышам Balb / c через хвостовую вену (доза RV составляла 15 мг / кг). Здоровых мышей, которым вводили физиологический раствор таким же образом, использовали в качестве контрольной группы. В дни 0, 10 и 45 после инъекции кровь мышей собирали для оценки количества клеток, включая лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC), гемоглобин (HGB) и средний объем тромбоцитов (MPV). , средний гемоглобин эритроцитов (MCH), гематокрит (HCT), средняя концентрация гемоглобина эритроцитов (MCHC), средний объем эритроцитов (MCV) и тромбоцит (PLT). Кроме того, ткани сердца, печени, селезенки, легких и почек каждой группы были собраны для окрашивания H&E на 45-й день.

Статистический анализ

Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (s.d.). Статистический анализ образцов проводился с использованием t Стьюдента. test и p <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика RV @ Ft-RGD

Загрузка RV и высвобождение из RV @ Ft-RGD осуществляли посредством индуцированной pH обратимой разборки и повторной сборки Ft (рис. 1). Сначала ферритин конъюгировали с пептидом, нацеленным на опухоль RGD, с образованием Ft-RGD. Затем его повторно растворяли в ацетатном буфере (pH =5), чтобы разобрать полипептидные субъединицы и сформировать полую пористую сферу. Затем добавляли молекулы RV и позволяли войти в полость, после чего раствор медленно доводили до pH ≈ 7,4 для повторной сборки Ft, улавливая молекулы RV внутри герметичной полости Ft. Когда pH буфера затем снижается до ~ 5, поры наночастиц обратимо открываются и высвобождают свои молекулы RV. Рисунок 2a и дополнительный файл 1:Рисунок S1 показывает изображения SEM и TEM собранного RV @ Ft-RGD, который имеет сферическую структуру. Согласно анализу DLS, частицы RV @ Ft-RGD имели больший диаметр (~ 22,5 нм) по сравнению с необработанными наночастицами Ft (~ 11,8 нм) (рис. 2b) и имели такие же дзета-потенциалы, что и необработанные наночастицы Ft (-29,6 мВ) (рис. . 2в). Через 20 дней индекс полидисперсности (PDI) RV @ Ft-RGD в воде, FBS, клеточной среде и PBS не показал значительных изменений (фиг. 2d), что указывает на то, что RV @ Ft-RGD обладал замечательной коллоидной стабильностью. На рис. 2е показаны спектры поглощения свободных RV, Ft-RGD и RV @ Ft-RGD. Как можно видеть, по сравнению со спектром RV и Ft-RGD, в спектре поглощения RV @ Ft-RGD появился новый пик при 306 нм (исходящий от RV), что указывает на успешную загрузку RV. Кроме того, RV @ Ft-RGD показал такую ​​же значительную эмиссионную флуоресценцию, как и свободный RV, на длине волны 400 нм при возбуждении лазером с длиной волны 325 нм (рис. 2f).

Схематическое изображение препарата RV @ Ft-RGD и нацеленной на опухоль химиотерапии

а ПЭМ-изображение RV @ Ft-RGD. б , c Распределение по размерам и распределение дзета-потенциала Ft-RGD и RV @ Ft-RGD. г Изменение PDI RV @ Ft-RGD в воде, FBS, клеточной среде и PBS в течение 20 дней. е Спектры поглощения свободных RV, Ft-RGD и RV @ Ft-RGD. е Спектры поглощения свободных RV и RV @ Ft-RGD

Загрузка и выдача лекарств

Максимальная несущая способность Ft-RGD составила 252,6%, вероятно, из-за большой полости внутри полого Ft-RGD. Поскольку Ft чувствителен к pH, мы смогли охарактеризовать нагрузочную способность RV при различных условиях pH. Как показано на фиг. 3a, с увеличением pH от 5,0 до 8,5 эффективность загрузки RV резко снизилась. Высвобождение RV из комплекса также было охарактеризовано при различных значениях pH от 5,0 до 8,5. Профиль высвобождения правого желудочка, зависящий от значения pH и времени, был построен на основе этих данных и показан на рис. 3b. Максимальный коэффициент высвобождения лекарственного средства (51,6%) наблюдался при pH =5,0 в течение 24 часов, что было выше, чем при pH =6,5, 7,4 и 8,5. Согласно соответствующим сообщениям, значения pH 5,0, 6,5 и 7,4 обычно встречаются в лизосомах клеток, опухолевых тканях, крови и нормальной физиологической среде соответственно [31]. В физиологических условиях (pH 7,4) содержание лекарственного средства в RV @ Ft-RGD оставалось высоким даже через 50 часов (фиг. 3c), что позволяет предположить, что RV @ Ft-RGD является стабильным и не вытекает легко. Кроме того, мы исследовали изменение диаметра RV @ Ft-RGD при нескольких различных условиях pH. После инкубации при 37 ° C в течение 12 ч анализ DLS показал, что диаметр RV @ Ft-RGD был почти постоянным, около 23 нм при pH 8,5 и 7,4. Когда значение pH снижалось до 6,5 и 5,0, диаметр RV @ Ft-RGD увеличивался до 25 нм и 28,6 нм соответственно (рис. 3d). Эти результаты подтверждают поведение индуцированной pH обратимой разборки и повторной сборки RV @ Ft-RGD, что полезно для контролируемой загрузки лекарственного средства in vitro и высвобождения лекарства в опухолевой ткани.

а Эффективность загрузки Ft-RGD в условиях различных pH. б Профиль высвобождения RV из RV @ Ft-RGD в различных условиях pH от 5,0 до 8,5. c Постоянный ПЖ в RV @ Ft-RGD в физиологическом состоянии. г Изменение среднего размера RV @ Ft-RGD в различных условиях pH от 5,0 до 8,5

Использование и локализация клеток in vitro

Затем оценивали клеточное поглощение и локализацию RV @ Ft-RGD. Во-первых, RV @ Ft и RV @ Ft-RGD были помечены FITC посредством взаимодействия водородных связей и физического поглощения. Как показано на фиг. 4а, клетки, обработанные свободным FITC, показали незначительные сигналы цитоплазматической флуоресценции. Клетки, обработанные RV @ Ft-RGD, напротив, проявляли интенсивную зеленую флуоресценцию FITC, которая была выше, чем у клеток, обработанных RV @ Ft. Примечательно, что клетки, обработанные RV @ Ft-RGD и предварительно обработанные RGD, показали низкую зеленую флуоресценцию. Из этих результатов мы можем заключить, что RV @ Ft-RGD поглощался клетками в больших количествах, вероятно, за счет RGD-опосредованного активного целевого эффекта. Эти обработанные клетки также анализировали с помощью FCM, результаты которого показаны на фиг. 4b. Статистические результаты интенсивности флуоресценции клеток позволяют сделать аналогичный вывод.

а Флуоресцентные изображения клеток A549 после инкубации со свободными FITC и FITC, меченными RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD и RV @ Ft-RGD, соответственно. Масштабная линейка =60 мкм. б Измерение с помощью FCM интенсивности клеточной флуоресценции FITC в клетках A549 после инкубации со свободными FITC и FITC, меченными RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD и RV @ Ft-RGD, соответственно. c Коэффициент совместной локализации клеточной флуоресценции FITC и Lyso Tracker Red. ** P <0,01, по сравнению с другими группами, соответственно

Чтобы изучить локализацию RV @ Ft-RGD в органеллах, для окрашивания клеток, инкубированных с наночастицами, использовали окрашивающий краситель, специфичный для лизосом (Lyso Tracker Red). Как видно на рис. 4а, цитоплазма показала сильную красную флуоресценцию во всех группах. После слияния с зеленой флуоресценцией FITC, RV @ Ft-RGD показал наиболее интенсивную желтую (зеленый + красный) флуоресценцию в цитоплазме среди этих групп. На основании статистического анализа группа, получавшая RV @ Ft-RGD, имела самый высокий коэффициент совместной локализации между флуоресценцией FITC и Lyso Tracker Red (фиг. 4c). Эти результаты показывают, что RV @ Ft-RGD может активно проникать в клетки, а затем переноситься в кислую среду лизосомы (pH ≈ 5,0). Эти достоинства, вместе с высвобождением лекарственного средства в зависимости от pH, наделяют RV @ Ft-RGD множеством потенциальных применений для терапии опухолей in vivo.

Биосовместимость in vitro и терапия опухолей

Перед изучением противоопухолевых свойств RV @ Ft-RGD была исследована цитотоксичность носителя Ft-RGD. Как показано на фиг. 5a и в дополнительном файле 1:фиг. S2 и S3, Ft-RGD не показал очевидного подавления жизнеспособности клеток рака легкого A549 и клеток NCI-H358 при концентрациях до 1 мг / мл. Морфология клеток также не показала значительных изменений, когда клетки, обработанные 1 мг / мл, сравнивали с контрольными группами (фиг. 5b), что ясно указывает на то, что Ft-RGD в качестве носителя обладает превосходной биосовместимостью. Как показано на фиг. 6a, b, свободный RV, RV @ Ft и RV @ Ft-RGD все убивают клетки в зависимости от концентрации. Клетки, обработанные RV @ Ft-RGD, показали большее снижение жизнеспособности и имели только 11,2% жизнеспособности клеток в группах с 40 мкг / мл, что было ниже, чем в группах, предварительно обработанных RV @ Ft-RGD + RGD. Предварительное исследование с FCM далее показало, что либо с одним RV, либо с RV @ Ft, либо с RV @ Ft-RGD, большая часть гибели клеток опосредована апоптозом (фиг. 6c). Эти результаты демонстрируют, что эффект RV по уничтожению опухолевых клеток был значительно усилен при загрузке в Ft-RGD, в основном из-за повышенного накопления RV @ Ft-RGD в лизосоме, где кислая среда pH вызывала повышенное высвобождение RV, способствующего апоптозу. в цитоплазму [32, 33].

а Цитотоксичность in vitro в отношении клеток A549, обработанных различными концентрациями Ft-RGD в течение 24 часов. б Микроскопическое изображение клеток A549 после 24-часовой обработки 1 мг / мл Ft-RGD

а Жизнеспособность клеток A549, обработанных RV, при различной концентрации. б Жизнеспособность клеток, обработанных RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD и RV @ Ft-RGD с различной концентрацией RV. c Апоптоз клеток A549, обработанных PBS (контроль), RV, RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD и RV @ Ft-RGD с помощью проточной цитометрии. ** P <0,01, по сравнению с другими группами, соответственно

Период полураспада крови RV @ Ft-RGD

Концентрацию RV в плазме крови в разное время после инъекции изучали в группах, получавших свободный RV и RV @ Ft-RGD, соответственно. Как показано на фиг. 7а, период полувыведения RV @ Ft-RGD из крови составлял 5,1 ± 0,23 часа. Free RV вымывался из кровотока быстрее, с периодом полураспада в крови всего 0,43 ± 0,11 часа. Значительно увеличенный период полужизни RV @ Ft-RGD в крови способствует улучшению удержания лекарств в системном кровотоке и способствует накоплению лекарств в опухолевых участках.

а Время циркуляции свободных RV и RV @ Ft-RGD в крови. б Профиль роста опухолей с ксенотрансплантатом A549 после трехкратной внутривенной инъекции физиологического раствора (контроль), RV, RV @ Ft, RV @ Ft-RGD + RGD и RV @ Ft-RGD. Красная стрелка указывает момент времени впрыска. ** P <0,01 по сравнению с другими группами соответственно. c Масса тела мышей с опухолями после различных курсов лечения. г Микрофотографии окрашенных H и E срезов опухоли, полученных от разных групп мышей после окончания лечения. Шкала 50 мкм

Противоопухолевый эффект in vivo и системная токсичность RV @ Ft-RGD

На Фигуре 7b показан профиль роста опухоли мышей-опухоленосителей при различном лечении, который был выражен в виде относительного объема опухоли. Рост опухоли подавлялся до некоторой степени при лечении RV @ Ft, вероятно, из-за низкого поглощения RV @ Ft. Однако в группе, получавшей RV @ Ft-RGD, рост опухоли был значительно подавлен по сравнению с другими группами (контроль, RV, RV @ Ft и RV @ Ft-RGD + RGD). Во время лечения не было заметной потери массы тела ни в одной экспериментальной группе (рис. 7c), что свидетельствует о высокой биобезопасности RV @ Ft-RGD. После окончания курса лечения для исследования химиотерапевтических эффектов проводили окрашивание опухолевой ткани H&E в этих группах. Как показано на рис. 7d, большая область апоптоза наблюдалась в опухолях, обработанных RV @ Ft-RGD, что значительно контрастирует только с небольшой площадью апоптоза в опухолях, обработанных свободным RV, RV @ Ft и RV @. Ft-RGD + RGD. Кроме того, системная токсичность RV @ Ft-RGD также оценивалась на нормальных мышах. Образцы цельной крови здоровых мышей, обработанных физиологическим раствором и RV @ Ft-RGD, собирали через 0, 10 и 45 дней после инъекции для анализа крови. Как показано на рис. 8a, b, полные анализы крови (WBC, RBC, HGB, MPV, MCH, HCT, MCV, PLT и MCHC) мышей, которым инъецировали RV @ Ft-RGD, не показали значительных различий от 0 дня до 45 дн. Основные органы здоровых мышей, обработанных физиологическим раствором и RV @ Ft-RGD, также собирали через 45 дней для окрашивания H&E. В этих тканях не было обнаружено явных побочных эффектов (рис. 8c), что свидетельствует о незначительной долгосрочной неблагоприятной токсичности. Все эти результаты демонстрируют многообещающий потенциал RV @ Ft-RGD для усиленной химиотерапии рака in vivo.

а Анализ крови здоровых мышей, получавших RV @ Ft-RGD в течение 45 дней. б Изображения основных органов, окрашенных H &E, здоровых мышей, получавших RV @ Ft-RGD в течение 45 дней. c Окрашивание HE отображает основные органы в контрольной группе и группе, обработанной RV @ Ft-RGD. Шкала 50 мкм

Заключение

Таким образом, мы успешно разработали pH-индуцированную систему обратимой сборки (PIRAS) с контролируемой pH-загрузкой и высвобождением противоопухолевого препарата против РВ для усиленной химиотерапии, направленной на опухоль. В кислых (pH =5,0) условиях система может разбираться и загружать или высвобождать RV, в то время как в нейтральных условиях (pH =7,4) RV @ Ft-RGD очень стабильна и показывает незначительную утечку лекарства. Посредством RGD-опосредованного целевого эффекта RV @ Ft-RGD может поглощаться в высоких концентрациях клетками A549 и накапливаться в лизосомах, что благоприятно для высвобождения RV как in vitro, так и in vivo. Из-за накопления RV @ Ft-RGD в лизосоме и вызывающего pH кислотного лизосомы высвобождения RV в цитоплазму, RV @ Ft-RGD продемонстрировал превосходные эффекты уничтожения опухолевых клеток и стимуляции апоптоза по сравнению со свободным RV. Кроме того, после загрузки RV в Ft-RGD, RV @ Ft-RGD показал гораздо более длительный период полувыведения в крови, чем у свободного RV. Результаты in vivo демонстрируют, что RV @ Ft-RGD демонстрирует заметное подавление опухоли и не проявляет заметной системной токсичности. Это исследование предполагает, что PIRAS на основе Ft очень эффективен при загрузке и высвобождении лекарств для усиленной противоопухолевой терапии.

Доступность данных и материалов

Выводы, сделанные в этой рукописи, основаны на данных, которые все представлены и показаны в этой статье.

Сокращения

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

CCK-8:

Набор для подсчета клеток-8

DLS:

Динамическое рассеяние света

EDC:

1-Этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

FITC:

Флуресцеин изотиоцианат

Ft:

Ферритин

HCT:

Гематокрит

HGB:

Гемоглобин

MCH:

Средний корпускулярный гемоглобин

MCHC:

Средняя концентрация корпускулярного гемоглобина

MCV:

Средний корпускулярный объем

MPV:

Средний объем тромбоцитов

NHS:

N-гидроксисукцинимид

ПИРАС:

Система обратимой сборки, индуцированная pH

PLT:

Тромбоциты

RBC:

Эритроциты

RGD:

Арг-Гли-Асп

RV:

Ресвератрол

WBC:

Лейкоциты