Определение низкомолекулярных AGE на основе наночастиц золота из образцов гликированного гемоглобина A0 in vitro

Фон

Сахарный диабет II типа (СД2) - сложное метаболическое расстройство, характеризующееся высоким уровнем сахара в крови. Сохраняющаяся в организме гипергликемия инициирует ряд химических и биохимических реакций, и наиболее важная реакция, которая происходит в течение гипергликемии, известна как реакция Майяра, которая включает неферментативную реакцию между сахарами и белком с образованием обратимого альдимина (основание Шиффа). связь. Относительно нестабильное основание Шиффа таутомеризуется в более стабильную кето-форму, которая также известна как «продукт Амадори» [1]. Продукты Амадори, также называемые промежуточными продуктами гликирования или продуктами раннего гликирования, подвергаются групповым перегруппировкам, циклизации, дегидратации, реакциям разложения с образованием ряда химических соединений. Эти соединения известны как потенциальные сшивающие агенты для белков и гликозилирующих агентов [2]. Они подвержены дальнейшей деградации, ведущей к образованию конечных продуктов гликирования (AGE) [3]. При высоких эндогенных концентрациях AGE вносят свой вклад в осложнения диабета [4], индуцируя перекрестные сшивки белков или посредством рецепторной передачи внутриклеточного сигнала (RAGE), что приводит к окислительному стрессу и воспалению [5, 6]. Также известно, что он связан с сердечно-сосудистыми заболеваниями [7, 8], нефропатиями [9, 10], ретинопатиями [11, 12], старением [13, 14], артритом, раком [15,16,17], нейродегенеративными заболеваниями. как болезнь Альцгеймера [15] и развитие депрессии [18]. Помимо реакции Майяра, несколько других путей, включая окисление глюкозы, перекисное окисление липидов и путь полиола, также приводят к образованию AGE [19, 20] in vivo. В дополнение к этому, диетическое потребление определенных продуктов, которые, как известно, богато AGE, также вносят вклад в общий AGE в организме [6].

Хотя большинство продуктов AGE имеют общий структурный элемент [21], точные химические структуры сотен AGE еще предстоит идентифицировать [22]. Несмотря на их гетерогенность, образование ковалентных поперечных связей с белком и «эффект потемнения» типичны для всех известных AGE [23]. Аддукты с участием сахара и белка, которые образуются на ранней стадии гликирования, называют аддуктами раннего гликирования. Фруктозиллизин и фруктозамин являются примерами таких структур и являются потенциальными сшивающими агентами [24,25,26]. Некоторые из широко изученных возрастных групп включают N -карбоксиметил-лизин (CML), N -карбоксиэтил-лизин (CEL) [27], пентозидин [28], глюкозепан [29], пирралин, аргпирамидин, Crossline и весперлизин C [30].

Исследования роли AGE в прогрессировании диабета, старения и связанных с ним осложнений растут, и, как сообщается, они являются хорошим биомаркером для соответствующих исследований [https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02863224] [ 31,32,33,34]. Однако сложность и неоднородность структуры AGE является серьезным препятствием на пути разработки универсальной системы обнаружения [35]. Качественный анализ AGE обычно проводится с помощью спектроскопических и колориметрических методов [36], в которых эволюция продуктов реакции Майяра отслеживается либо путем измерения увеличения поглощения света при 280 нм, что соответствует ранним продуктам реакции Майяра [37], либо путем измерения излучение флуоресценции при 450 нм [38,39,40,41,42]. Исследования по идентификации отдельных продуктов AGE все еще продолжаются; однако были предприняты попытки количественного определения пентозидина [43] и карбоксиметиллизина [44]. Большинство AGE изучали на тканевом уровне с помощью иммуногистохимии и количественного анализа на основе ELISA с использованием ряда поли- и моноклональных антител [21, 45]. На сегодняшний день наилучшим доступным аналитическим методом для определения AGE является жидкостная или газовая хроматография с последующим спектрофотометрическим или масс-спектрометрическим обнаружением [12, 46,47,48,49]. Количественный анализ AGE по-прежнему представляет собой серьезную техническую проблему, и немногочисленные методы, доступные для того же, дороги и, таким образом, ограничивают его использование в приложениях для оказания медицинской помощи. Разработка новых стратегий качественной и количественной оценки AGE является неотложной задачей из-за их влияния на опасные для жизни заболевания.

Большие усилия были приложены к разработке колориметрических датчиков благодаря их простоте в обнаружении, быстрому времени отклика и экономической эффективности, особенно для биологических приложений [50]. Среди них сенсоры на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР) представляют особый интерес из-за их высокой чувствительности обнаружения [51]. В настоящем исследовании мы исследовали оптические свойства наночастиц золота (ЗНЧ) для качественной идентификации продуктов AGE. ЗНЧ известны своим уникальным настраиваемым SPR и поэтому превратились в колориметрический репортер для обнаружения различных биомолекул. К оптическим сенсорам на основе ЗНЧ относятся сенсоры малых химических аналитов [52], сахаров [53], различных белков [54], белковых агрегатов [55] и конформационных вариантов белка [56]. Ранее мы показали, что ЗНЧ при посеве на матрицу гликированного белка могут отвечать на усиление гликирования [57]. Здесь мы расширили эту концепцию для качественного определения различных продуктов гликирования колориметрически, используя восстанавливающие свойства, проявляемые AGE. Вкратце, HbA0 был гликирован in vitro с использованием фруктозы в качестве восстанавливающего сахара, образование AGE и связанные с ним структурные изменения в основной цепи белка были подтверждены с помощью спектроскопии. Гликированный гемоглобин фракционировали с использованием гель-фильтрационной хроматографии для разделения продуктов на основе их молекулярной массы, и ЗНЧ были синтезированы с использованием полученных фракций. Только небелковые продукты AGE направляли синтез наноструктур золота, что позволяло их идентифицировать.

Все больше данных подтверждают участие различных продуктов гликирования в заболеваниях, включая диабет, старение, болезнь Альцгеймера, почечные заболевания, атеросклероз и различные виды рака. Наши результаты подчеркивают использование ВНЧ в качестве простой и высокочувствительной колориметрической сенсорной платформы для идентификации различных продуктов AGE, которые могут быть задействованы в прогнозе осложнений, связанных со здоровьем, связанных с диабетом.

Методы

Материалы

Гемоглобин A0 (HbA0) и сефадекс (G25) были получены от Sigma Aldrich India Pvt. Ltd. Тригидрат тетрахлораурата (III) водорода (HAuCl ₄ .3H ₂ O) был приобретен у Loba Chemie. Фруктоза, дигидроортофосфат калия, дикартофосфат калия, дигидроортофосфат натрия, динатрий-ортофосфат водорода, феррицианид калия, трихлоруксусная кислота, хлорид железа, азотная кислота (HNO ₃ ), соляная кислота (HCl), акриламид, бисакриламид, персульфат аммония, TEMED, додецилсульфат натрия, кумасси бриллиантовый синий, глицерин, дитиотреитол, основание TRIS и другие использованные химические вещества были аналитической степени чистоты и использовались без дополнительной очистки. Во всех экспериментах использовалась сверхчистая вода MilliQ (> 18 МОм).

Методы

Гликирование HbA0

Исходные растворы HbA0 и фруктозы готовили в автоклавированном калий-фосфатном буфере (0,1 М, pH 7,4) и фильтровали с использованием шприцевых фильтров 0,2 мкм перед использованием. Образцы HbA0 инкубировали с разными концентрациями фруктозы в течение разных периодов времени (от 1 до 10 дней) в инкубаторе при 37 ° C. Конечные концентрации фруктозы и HbA0 составляли 0,1 М и 1 мг / мл ^-1 . соответственно. Также сохраняли контроль HbA0 и фруктозы с такими же концентрациями. Образцы, которые подвергали гликированию в течение 10 дней, помечаются префиксом «День 10», а контрольные образцы, которые не инкубировали, помечаются префиксом «День 0». Все эксперименты проводились в стерильных условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха.

Анализ с уменьшением свойств

Восстановительные свойства гликированных образцов определяли методом, описанным Gu. и другие. [37] с небольшими изменениями. Затем 100 мкл гликированных образцов и их соответствующие контрольные белки и сахара были смешаны с 1 мл 0,2 М натрий-фосфатного буфера и 1 мл 1% феррицианида калия. Смеси инкубировали при 50 ° C на водяной бане в течение 20 мин. После охлаждения смеси до комнатной температуры добавляли 1 мл 10% трихлоруксусной кислоты. К 1 мл этой смеси добавляли 1 мл воды MilliQ и 200 мкл 0,1% хлорида железа (III). Оптическую плотность полученной смеси измеряли при 700 нм. Сохраняли отрицательный контроль, в котором вместо гликозилированного образца добавляли 0,1 М фосфатный буфер, который служил холостой пробы для измерений оптической плотности. Чем выше поглощение при 700 нм, тем выше его восстанавливающие свойства.

Гель-фильтрационная хроматография Fruc-Hb дня 0 и Fruc-Hb дня 10 с использованием сефадекса (G25)

Вкратце, шарики сефадекса (G25) вымачивали в воде MilliQ на ночь, затем помещали в стеклянную колонку длиной 15 см, диаметром 1 см и внутренним объемом 15 мл. Сначала колонку промывали обильным количеством воды MilliQ, а затем буферным раствором фосфата калия (0,1 М, pH 7,4). Приблизительно 600 мкл образца Fruc-Hb загружали в колонку после ее уравновешивания с фосфатным буфером. Элюцию проводили тем же буфером при скорости потока 7,5 мл в час. Фракции собирали после того, как загруженный образец пересекал колонку на расстоянии примерно 10 см. Приблизительно 30 фракций были собраны из каждого образца и после этого охарактеризованы. Здесь Fruc-Hb на день 0 и полученные из него фракции служили контролем по сравнению с образцом Fruc-Hb на 10 день и их соответствующими фракциями.

Синтез наночастиц золота

Вся стеклянная посуда, используемая для синтеза ЗНЧ, была промыта царской водкой (HCl:HNO ₃ в соотношении 3:1 по объему) и перед использованием промыть этанолом и сверхчистой водой ( Осторожно! Королевская водка - очень едкий окислитель, с которым следует обращаться с большой осторожностью ). Синтез ЗНЧ осуществлялся с использованием восстанавливающих свойств продуктов гликирования Hb. В типичном эксперименте, проводимом при комнатной температуре (RT), 32 мкл водного раствора HAuCl ₄ (1% w / v ) добавляли к 3,868 мл воды MilliQ при постоянном перемешивании. После полного растворения соли золота раствор становится бледно-желтым. Затем к раствору соли золота добавляли 50 мкл необходимого образца Fruc-Hb или 100 мкл фракции. После того, как все реагенты были тщательно перемешаны, перемешивание прекращали и реакционную смесь оставляли нетронутой, чтобы позволить рост ЗНЧ. В конечной реакционной смеси концентрация образца Fruc-Hb составляла 12,5 нг мкл ^-1 . (12,5 мкг мл ^-1 ), а фракция составляла 1 нг мкл ⁻¹ (1 мкг мл ^-1 ) (Подробные расчеты приведены в S6). В зависимости от добавленного образца в реакционных смесях развивались цвета от розового до пурпурного. Все образцы выдерживали до тех пор, пока цвет реакционной смеси не стабилизировался, и никаких дальнейших изменений не наблюдалось.

Анализ Брэдфорда

Фракции, собранные из образцов Fruc-Hb, анализировали на наличие или отсутствие белка с помощью анализа Брэдфорда. Вкратце, к каждой из 20 мкл неразбавленных фракций добавляли около 200 мкл реагента Брэдфорда и измеряли оптическую плотность при 595 нм и 450 нм [58]. Отношение OD при 595 нм к 450 нм наносили на график в зависимости от номера фракции, и более высокое соотношение указывало на относительно более высокий процент белка.

Спектроскопия

УФ-видимая спектроскопия

УФ-видимые спектры всех образцов Fruc-Hb, их соответствующих контролей и хроматографические фракции гликированных образцов регистрировали на спектрометре Perkin Elmer, Lambda 25 UV-Vis. Спектры получали сканированием от 800 до 200 нм со скоростью сканирования 240 нм / мин и шириной щели 1 нм. Все измерения проводились с использованием кварцевых кювет объемом 1 мл с длиной оптического пути 1 см. Спектры ЗНЧ в УФ-видимой области были записаны аналогичным образом.

Флуоресцентная спектроскопия

Чтобы идентифицировать структурные изменения белка и образование AGE, профили флуоресцентного излучения образцов Fruc-Hb и фракций с 0-го дня Fruc-Hb и с 10-го дня Fruc-Hb были выполнены с использованием флуоресцентного спектрофотометра Agilent Technologies Cary Eclipse. Ширина щелей возбуждения и испускания была установлена ​​равной 5 нм, а спектры снимались с использованием кварцевой кюветы с длиной пути 1 см. Образцы возбуждали при 280 нм и 350 нм для проверки флуоресценции триптофана / собственной флуоресценции белка и флуоресценции AGE соответственно [34,35,36,37,38].

Спектроскопия кругового дихроизма

Изменения вторичной структуры в образцах Fruc-Hb были идентифицированы с помощью спектроскопии кругового дихроизма. Измерения проводились с использованием спектрометра кругового дихроизма (CD) с Stop Flow, Applied PhotoPhysics Chirascan (Applied Photophysics Limited, Великобритания). Спектры были сняты в дальнем УФ-диапазоне от 190 до 260 нм.

Для всех спектроскопических измерений образцы Fruc-Hb объемом 0,1 мг / мл ^-1 использовали концентрацию, и фракции Fruc-Hb на 0-й день и Fruc-Hb на 10-й день анализировали без какого-либо разбавления. Калий-фосфатный буфер (pH 7,4, 10 мМ) служил бланком во всех экспериментах. Все показания были сняты в трех экземплярах при комнатной температуре.

Просвечивающая электронная микроскопия

Для определения размера и структуры ЗНЧ, синтезированных из образцов Fruc-Hb и их соответствующих контролей, был проведен электронный микроскопический анализ с использованием просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) –JEOL 2100F. ЗНЧ концентрировали центрифугированием при 6000 об / мин и выливали по каплям на покрытые медью углеродные решетки с размером ячеек 300. Образцам давали высохнуть в течение ночи при комнатной температуре перед анализом.

Профиль интенсивности цвета ВНП

Чтобы выразить цвет ВНП в измеримых значениях, (RB) / G ((Интенсивность красного – Интенсивность синего) / Интенсивность зеленого) рассчитывалась путем извлечения красных, синих и зеленых цветовых плоскостей из каждого из золотых коллоидов с использованием цифрового цвета. метр.

Электрофорез в полиакриламидном геле в SDS

Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS PAGE) проводили, чтобы увидеть различия в молекулярной массе HbA0 после гликирования. Контроли HbA0 на день 0, день 10 и Fruc-Hb дня 0 и день 10 смешивали с 10% SDS, содержащим 6X загрузочный буфер, и кипятили в течение 5 минут, после чего 30 мкл образцов загружали в отлитый гель (Stacking gel- 5%; гель рассасывающийся - 12%). Образцы обрабатывали вместе с предварительно окрашенной белковой лестницей PiNK Plus 10-175 кДа (каталожный номер PM005 0500) при 100 В с использованием системы Mini PROTEAN Tetrad от Bio-Rad. Гели визуализировались под источником белого света осветителя Bio-Rad Trans.

Результаты

Синтез ВНЧ из фруктозы, гемоглобина A0 и гликозилированного гемоглобина A0

Известно, что редуцирующий сахар глюкоза реагирует с HbA0 in vivo с образованием HbA1c, хорошо известного аддукта раннего гликирования, который является основным биомаркером уровней гипергликемии, связанных с диабетом [59]. Для достижения более быстрой кинетики гликирования и высокого накопления AGE in vitro вместо глюкозы используется фруктоза, которая является мощным гликирующим агентом по сравнению с последним [55,56,57,58,59,60]. В нашем исследовании мы выполнили гликирование гемоглобина A0 с использованием фруктозы в качестве редуцирующего сахара, и гликирование отслеживалось до 10 дней, что, как сообщается, достаточно для существенного образования AGE [57]. На рисунке 1 показано образование AGE в образцах HbA0 после 10 дней инкубации с фруктозой in vitro. Образование AGE оценивали путем качественного измерения испускания флуоресценции на длине волны 450 нм при возбуждении на длине волны 350 нм [38,39,40,41,42]. Более чем десятикратное увеличение эмиссии флуоресценции при 450 нм подтвердило образование продуктов AGE в гликозилированном HbA0 (день 10 Fruc-Hb) по сравнению с негликозилированным HbA0 (день 0 Fruc-Hb - физическая смесь HbA0 и фруктозы без инкубации). Подробные биофизические характеристики образцов обсуждаются в Дополнительном файле 1 (S1 и S2).

Образование AGE измеряют по генерации флуоресценции при 450 нм, когда гемоглобин инкубируют с фруктозой в течение 10 дней. Сравнение эмиссии флуоресценции 450 нм в день 0 Fruc-Hb и день 10 Fruc-Hb

Чтобы использовать ЗНЧ в качестве колориметрического сенсора для AGE, полученных в результате гликирования белков, предварительным условием было изучение кинетики образования ЗНЧ из сахарных и белковых реагентов. Сообщается, что фруктоза и гемоглобин A0 направляют синтез наноструктур золота [53, 61, 62, 63] при использовании отдельно или в сочетании с сильным восстанавливающим агентом. Однако, чтобы понять разницу в кинетике образования, мы сравнили ЗНЧ, синтезированные из Fruc-Hb, фруктозы и HbA0, инкубированных в течение 0 и 10 дней соответственно в отсутствие дополнительного восстанавливающего агента. Восстановительные свойства этих матриц были измерены биохимически в соответствии с протоколом, описанным в разделе методов. В целом, образцы 10-го дня показали более высокую восстанавливающую способность, чем образцы 0-го дня, а Fruc-Hb продемонстрировал максимальное восстанавливающее свойство, за которым следовали фруктоза и HbA0 в обоих случаях, что может быть связано с присутствием AGE в образцах Fruc-Hb ( Рис. 2а). Из этих образцов при типичной концентрации только 10-й день Fruc-Hb способствовал синтезу стабильных ЗНЧ (рис. 2b) к концу 4-х дней, тогда как остальные образцы могли делать это только тогда, когда им позволяли храниться в течение длительного времени (обычно более 10 дней), и результаты соответствуют полученным восстанавливающим свойствам образцов (данные не показаны). Спектр поглощения видимого света Fruc-Hb_GNP на 10-й день генерировал пик около 530 нм (фиг. 2c), и частицы также были охарактеризованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM) для изучения размера и морфологии (фиг. 2d). Электронная микрофотография показала наличие сферических частиц со средним диаметром 21,930 ± 2,4 нм (рис. 2д). Кроме того, частицы были поликристаллическими по своей природе с точками решетки, соответствующими 111, 200, 220, 311 плоскостям ГЦК-решетки (рис. 2f). Подробный кинетический анализ образования ЗНЧ из дифференциально гликированных образцов приведен в S3.

Характеристика образования AGE и синтеза ЗНЧ из образцов HbA0, фруктозы и Fruc-Hb. а Снижающие свойства HbA0, фруктозы, Fruc-Hb в течение 0 и 10 дней инкубации, соответственно, измеряли с помощью теста восстановления ионов трехвалентного железа. б Фотографии ЗНЧ, синтезированных из соответствующих образцов. c УФ-видимый спектр поглощения Fruc-Hb_GNPs за день 10. г Просвечивающая электронная микрофотография Fruc-Hb_GNP 10 дней (масштабная шкала:20 нм). е Распределение частиц по размерам и f SAED для частиц

Здесь Fruc-Hb действует как шаблон, а также как стабилизатор, направляя синтез золотых наноструктур сферической формы. Поскольку только на 10-й день Fruc-Hb обеспечивает синтез частиц за установленное время по сравнению с сахарными и белковыми аналогами, этот механизм можно использовать для дифференциации гликозилированной и негликированной белковой матрицы.

Фракционирование Fruc-Hb разрешает два разных класса продуктов гликозилирования

Было интересно посмотреть, являются ли AGE или изменения в белковой основе ответственны за наблюдаемый дифференциальный ответ SPR в GNPs, высеянных на 10-й день в матрице Fruc-Hb. Для дальнейшего исследования мы фракционировали Fruc-Hb на 10-й день и Fruc-Hb на 0-й день, используя гель-фильтрационную хроматографию, как описано в разделе о методах. Фракции, полученные с дня 0 Fruc-Hb, служили контролем по сравнению с фракциями Fruc-Hb с дня 10. Рисунок 3 суммирует спектроскопические характеристики фракций. На рис. 3а показаны профили элюирования фракций, собранных с 0-го дня Fruc-Hb (красный) и с 10-го дня Fruc-Hb (черный). Характерный профиль элюирования, полученный при фракционировании Fruc-Hb, согласуется с более ранними сообщениями [37].

Профиль элюирования фракций Fruc-Hb (красный) на 0 день и Fruc-Hb (черный) на 10 день. Профиль УФ-поглощения, измеренный при 280 нм ( a ) и анализ Брэдфорда на наличие белков ( b ) фракций с 0-го дня Fruc-Hb и с 10-го дня Fruc-Hb

Присутствие белка во фракциях с 0-го по 10-й день подтверждалось поглощением УФ-света при 280 нм ароматическими аминокислотами, присутствующими в белке. Профиль элюции Fruc-Hb на 10 день, измеренный по поглощению света при 280 нм, показывает присутствие двух популяций продуктов, обозначенных I и II. Популяция I, состоящая из продуктов с высоким молекулярным весом, колеблется от фракции № С 5 по 12 и фракция № 15 и далее, соответствующие низкомолекулярным продуктам, попадают в популяцию II. Небольшой диапазон, охватывающий 2–3 фракции, наблюдался между I и II, где УФ-поглощение не наблюдалось. С другой стороны, единичная популяция фракций из 0-го дня Fruc-Hb показала поглощение УФ-света (популяция I), подтверждая, что поглощение в области II во фракциях 10-го дня происходит за счет продуктов, образовавшихся на 10-й день Fruc-Hb в результате гликирования. Уже сообщалось, что промежуточные продукты реакции Майяра поглощают свет в ближнем УФ-диапазоне [64], что подтверждает наблюдение. Повышенное поглощение УФ-света при 280 нм фракциями 10-го дня по сравнению с фракциями 0-го дня может быть связано с обширным разворачиванием белка в результате гликирования, что приводит к экспозиции ароматических аминокислот (рис. 3a).

Гликирование значительно изменяет вторичные и четвертичные структуры белка, как обсуждалось в S1. Чтобы подтвердить структурный статус белка во фракциях, мы провели электрофорез фракций в полиакриламидном геле в SDS и обнаружили, что вместо мономерных и димерных полос наблюдались слитые полосы, подтверждающие сшивание белка в образце Fruc-Hb на 10 день. (Дополнительный файл 1:Рисунок S4).

Сравнивая профили элюирования Fruc-Hb на день 0 и Fruc-Hb на 10 день, мы обнаружили, что фракции, попадающие в популяцию I, имеют белковую природу, а вторая популяция, которая полностью отсутствовала во фракциях 0 дня (негликозированные), состоит из небелковые продукты гликирования. Эти результаты подтверждаются оценкой белка с помощью анализа Брэдфорда, в котором была подтверждена белковая природа фракций в популяции I как на 0-й, так и на 10-й день Fruc-Hb (рис. 3b). Вкратце, фракционирование Fruc-Hb на 10-й день с помощью гель-фильтрационной хроматографии дало две разные популяции фракций, обе поглощающие свет с длиной волны 280 нм, одна из которых белковая по своей природе, а другая небелковая.

Белковые продукты гликирования и небелковые продукты гликирования флуоресцентны по своей природе

Поняв элюирование продуктов гликирования белковой и небелковой природы, флуоресцентное излучение этих фракций измеряли при 450 нм, чтобы охарактеризовать присутствие продуктов AGE. Подобно профилю УФ-элюции, две популяции с испусканием флуоресценции наблюдаются для фракций 10-го дня, но ни одна из фракций 0-го дня не показала испускания флуоресценции при 450 нм, поскольку в 0-й день Fruc-Hb не образовывался AGE (рис. 4). Интенсивность флуоресценции значительно варьировала среди фракций на 10-й день, что указывает на различную химическую природу продуктов гликирования. В профиле флуоресцентного элюирования исходные элюаты, принадлежащие популяции I, состояли из продуктов гликирования с высокой интенсивностью флуоресценции. Это вместе с оценкой белка, показанной на фиг. 3, предполагает элюирование высоко флуоресцентных продуктов гликирования, которые содержат белковые структуры в этих фракциях. Вторая популяция демонстрировала меньшую интенсивность флуоресцентного излучения по сравнению с исходными фракциями. Было обнаружено, что они небелковые по своей природе (рис. 3b), но способны поглощать УФ-свет с длиной волны 280 нм (рис. 3a).

Сравнение флуоресценции AGE во фракциях Fruc-Hb на 0 день и Fruc-Hb на 10 день, выраженных как интенсивность испускания флуоресценции при 450 нм

Принимая во внимание УФ-поглощение (рис. 3) и флуоресцентное излучение фракций 10-го дня (рис. 4), очевидно, что фракционирование различает два разных класса продуктов гликирования HbA0. Популяция фракций, которые элюируются из колонки G25, изначально имеют высокую молекулярную массу, белковые по природе и излучают сильную флуоресценцию при 450 нм. Второй класс продуктов - это низкомолекулярные небелковые структуры, излучающие флуоресценцию при 450 нм, но сравнительно более низкую интенсивность. Поскольку оба продукта демонстрируют флуоресценцию AGE, белковые структуры могут быть продуктами AGE, поперечно связанными с белковой цепью, которые образуются первоначально во время реакции Майяра, а фракции второй популяции могут быть поздними продуктами гликирования, которые образуются в результате. деградации поперечных связей AGE-белка.

ВНП, засеянное на фракции из образца Fruc-Hb, позволяет дифференцировать продукты гликирования

Очевидно, что синтез ЗНЧ может быть использован для различения гликированной и негликированной матрицы (рис. 2). Теперь, чтобы исследовать, могут ли ЗНЧ дифференцироваться между белковыми и небелковыми элюатами с 10-го дня Fruc-Hb, мы синтезировали ЗНЧ, используя фракции, полученные с 10-го дня Fruc-Hb, как описано в методах. За цветом образованных ЗНЧ следили до тех пор, пока все образцы не стали стабильными.

Как показано на фиг. 5, ни одна из фракций, состоящих из белковых структур (популяция I), не продемонстрировала заметного образования ЗНЧ, тогда как фракции, содержащие небелковые продукты AGE (популяция II), продуцировали стабильные ЗНЧ, проявляющие диапазон цветов в коллоидном растворе. Образование ЗНЧ охарактеризовали с помощью спектроскопии в УФ-видимом диапазоне, и максимумы поглощения были нанесены на график в зависимости от номеров фракций. Данные спектроскопии хорошо подтверждают визуализированный цветовой профиль ЗНЧ. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что дифференциация гликозилированной белковой матрицы от негликированной белковой матрицы на основе механизма зондирования на основе ЗНЧ опосредована низкомолекулярными продуктами AGE, и тот же механизм может использоваться для различения белковых и низкомолекулярных белков. -белковые продукты гликирования.

Синтез ВНП из фракций Fruc-Hb на 10-е сутки. Колориметрический профиль ЗНЧ, синтезированных из фракций 10-го дня, и их максимумы поглощения в зависимости от номера фракции

Кинетика колориметрического зондирования на основе ЗНЧ может быть улучшена в более широких масштабах путем простого увеличения концентраций Fruc-Hb и соли золота, тем самым сокращая время отклика. When the concentrations of the Fruc-Hb and gold salt was increased four times than the concentrations used initially in this study, GNP formation was completed within 1 day, substantiating the use of the proposed colorimetric sensor for point-of-care applications (Additional file 1:Figure S5).

The linearity of detection for this colorimetric sensor was also confirmed using different concentrations of the day 10 glycosylated HbA0 (day 10 Fruc-Hb) (Fig. 6). Colour formation was not prominent enough for the lower concentrations of day 10 Fruc-Hb used, and as the concentration was increased from 20 to 40 ng/μL, the colour intensity increased linearly. This confirms that the colour intensity profile extracted from the GNPs obtained from differentially glycated haemoglobin samples can be used for qualitative measurement of AGEs in respective samples.

Linearity of detection. The red colour intensity as quantified by (R-G)/B intensity of GNP colloids plotted against the concentration of day 10 Fruc-Hb used for the synthesis. The concentration was varied from 8 to 40 ng/μL

Discussion

The study presented here provides a detailed mechanism of GNP formation from a glycosylated HbA0 template and also discusses how this technique can be expanded for highly sensitive detection of AGE products in a simple manner. Our primary objective for this work was to establish a colorimetric sensing mechanism based on GNPs for the differentiation of glycated and non-glycated samples. The glycated HbA0 was found to be having high reducing property in comparison to the protein and sugar counterparts, enabling formation of stable and mono dispersed GNPs (Fig. 2). Since, among the control samples tested for GNP synthesis, only day 10 Fruc-Hb showed AGE fluorescence, the reactivity can be attributed to the AGE products than a mere structural alterations of the due to glycation (Figs. 1 and 2). To confirm this norm further, the products of glycation obtained from day 10 Fruc-Hb was fractionated to separate the products according to their molecular weights.

Fractionation of glycated Hb segregated two major population of products, high molecular weight proteinaceous (population I) and low molecular weight non-proteinaceous (population II) glycation products (Figs. 3 and 4). When GNPs were synthesised using these fractions of day 10 Fruc-Hb, it was found that only the products belonging to population II, the non-proteinaceous glycation products, were capable of carrying out the synthesis of particles (Fig. 5). This confirmed that the non-proteinaceous AGE products can initiate GNP synthesis by their own and the formation of GNPs from a Fruc-Hb template can be clearly attributed to the AGEs. Also, this opens up the possibility of using this property for the colorimetric detection of AGE products along with the distinction between proteinaceous and non-proteinaceous glycation products of HbA0.

Generally, CARBONYL groups present in the protein and sugar enable the stable synthesis of gold nanostructures in biological syntheses. Here, the generation of AGE products consisting of dicarbonyl functional groups during glycation might be providing the reducing environment for the proposed GNP synthesis [65]. As a matter of fact, the suggested mechanism can be used for the detection of advanced lipid per-oxidation end products (ALEs) as well, since the latter is also characterised by dicarbonyl functional groups and shares structural similarities with AGEs [66]. In short, GNPs synthesised from fractionated glycosylated Hb samples can clearly distinguish between proteinaceous and non-proteinaceous products. Our GNP-based simple colorimetric sensing of glycation products is highly sensitive and can detect nanogram levels of glycation products (S6) in a concentration-dependent manner (Fig. 6). The detection limit using the proposed sensing mechanism for the fractions is 1 ng/μL. The method developed in here can be scaled down to smaller reaction volumes without affecting the reaction kinetics, thus enabling lower sample requirements (data not shown) as well as enhance the reaction kinetics by increasing the concentrations (S5).

Выводы

Concisely, in this study, we have demonstrated a colorimetric sensing mechanism for the non-proteinaceous AGE products which is simple and highly sensitive with a detection limit down to nanogram levels. Conditions like type 2 diabetes requires continuous monitoring of sugar levels at regular time intervals. Currently, levels of HbA1c formed as a result of extensive glycation of haemoglobin is used as a diagnostic means for diabetes. Chromatographic [67], electrophoretic and advanced technologies including high-performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS) [12, 46,47,48,49, 68] are used for HbA1c detection. Early glycation adducts including fructosamines are also indicative of the glycemic control [69] which can be used as a marker for diabetes detection. Monitoring the AGE levels in addition to the HbA1c levels can significantly improve the determination the degree of complexity associated with diabetes, since the advancement of the disease is often associated with AGE formation and is involved in the progression of the disorder as well. Till date, the LC-MS/MS offers the highest selectivity and sensitivity in AGE detection [70]. But when it comes to simple, cost-effective, point-of-care diagnostics, our method can detect few nanograms of the sample compared to other fluorescence emission-based techniques [71, 72]. The method is highly specific for the AGEs, such that sugars and proteins do not develop any colour as such which are the expected interferences in the clinical samples such as blood or serum for the proposed study (Additional file 1 section 7). In this study, we have also segregated the products of glycation to proteinaceous and non-proteinaceous components and proved that non-proteinaceous AGEs are more reactive by the GNP based colorimetric assay. Further research can explore how this idea can be expanded for the distinction between different AGEs and thereby apply it for the diagnosis of organ specific diabetes-related complications.

Сокращения

AGEs:

Advanced glycation end products

Fruc-Hb:

Glycated Hb

GNPs:

Наночастицы золота

HbA0:

Haemoglobin A0

SPR:

Поверхностный плазмонный резонанс