Тераностические агенты нового поколения на основе полиэлектролитных микрокапсул, кодированных полупроводниковыми нанокристаллами:разработка и функциональная характеристика

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика микрочастиц карбоната кальция

Использование в качестве субстрата сферических неорганических кристаллов, в частности микросферолитов карбоната кальция, определяется их биосовместимостью, а также возможностью их удаления в процессе формирования микрокапсул полиэлектролитов без использования агрессивных для живых систем растворителей. Микрочастицы карбоната кальция сами по себе также могут использоваться в качестве системы доставки лекарств с модифицированным или пролонгированным высвобождением, служа в качестве матрицы для загрузки лекарств и контроля их высвобождения в микросреде, т.е. они имеют множество потенциальных применений в системах доставки [36,37 , 38,39,40,41,42,43,44,45,46].

Ключевыми факторами, определяющими размер и форму микрокристаллов, являются скорость и продолжительность перемешивания, а также время инкубации реакционной смеси [33, 41]. Нами экспериментально определены условия получения микросферолитов карбоната кальция с оптимальным гранулометрическим составом. Одиночный CaCO ₃ Было обнаружено, что микрочастицы имеют почти правильную округлую форму. Дополнительный файл 1. На рисунке S2 показано распределение размеров микрочастиц карбоната кальция, полученных при различных скоростях перемешивания. Как видно из этих данных, неоднородность размеров частиц увеличивалась с увеличением скорости перемешивания. Если скорость перемешивания составляла 250 об / мин, размер полученных частиц составлял от 4,0 до 6,0 мкм. В этом случае все микрочастицы в образце были отдельными, а их распределение по размерам было близким к нормальному (дополнительный файл 1:рисунок S2a). Однако, если смесь перемешивали при 500 об / мин, мы наблюдали частицы неправильной формы, которые представляли собой агрегаты более мелких частиц, средний размер отдельных частиц варьировался от 2,7 до 5,6 мкм (дополнительный файл 1:рисунок S2b). При скорости перемешивания 750 об / мин разброс частиц по размеру увеличивался. Этот образец также содержал агрегаты неправильной формы со средним размером отдельных микрочастиц в диапазоне от 3,8 до 5,7 мкм (дополнительный файл 1:рисунок S2c).

Таким образом, перемешивание реакционной смеси со скоростью 250 об / мин позволило получить частицы с оптимальным распределением по размерам и почти правильной формой и предотвратить агрегацию частиц. Таким образом, мы оценили влияние продолжительности перемешивания на распределение микрочастиц по размеру при этой скорости перемешивания (дополнительный файл 1:Рисунок S3). Перемешивание реакционной смеси в течение 15 с приводило к увеличению количества более крупных частиц по сравнению с перемешиванием 30 с. Аналогичный эффект имело увеличение продолжительности перемешивания до 60 с. То есть продолжительность перемешивания была недостаточной в первом случае (Дополнительный файл 1:Рисунок S3a) и чрезмерной во втором случае (Дополнительный файл 1:Рисунок S3c). Таким образом, оптимальными условиями перемешивания мы сочли скорость 250 об / мин и продолжительность 30 с.

По данным сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) поверхность микрочастиц карбоната кальция была неоднородной, характеризовалась пористостью (рис. 1а). При увеличении × 40000 можно было увидеть, что микрочастицы, в свою очередь, образованы более мелкими частицами субмикронного размера (рис. 1b). Таким образом, полученные микрочастицы имели пористую структуру и представляли собой матрицы, которые не только подходят в качестве субстратов, но также могут быть использованы сами по себе в качестве систем доставки и благодаря особой структуре поверхности могут быть легко использованы в качестве матрицы для послойного нанесения. осаждение полимеров.

Сканирующие электронные микрофотографии микрочастиц карбоната кальция ( a ) и их поверхность при большем увеличении ( b )

Приготовление и характеристика микрокапсул из полиэлектролита, кодированных квантовыми точками

Полученные водорастворимые КТ характеризовались широким спектром поглощения и узким спектром флуоресценции с максимумом излучения 590 нм (рис. 2). Гидродинамический диаметр этих образцов КТ составлял от 23,96 до 28,2 нм. Дополнительный файл 1. На рисунке S4 показано распределение размеров КТ, стабилизированных HS- (PEG) ₁₂ -COOH. Модификация поверхности КТ с помощью HS− (PEG) ₁₂ −COOH обеспечивал стабильность КТ в водной фазе, а также поверхностный отрицательный заряд, достаточный для эффективной адсорбции КТ между положительно заряженными слоями полиэлектролита во время процедуры кодирования [22, 47].

Оптические характеристики квантовых точек ядро ​​/ оболочка CdSe / ZnS, солюбилизированных HS- (PEG) ₁₂ -COOH лиганды

Измеренные значения поверхностного заряда образцов микрочастиц карбоната кальция на каждом этапе осаждения слоев полиэлектролита и квантовых точек (таблица 1) подтвердили, что поверхностный заряд исходной матрицы, солюбилизированных квантовых точек, а также перезарядка поверхности после каждого осаждения полимеров достаточны для эффективного впитывания каждого последующего слоя.

Собственный поверхностный заряд и пористая структура поверхности синтетических микрочастиц карбоната кальция позволили использовать их в качестве матрицы для противоположно заряженного полиэлектролита и осаждения КТ (рис. 3). Применение полимеров ПАУ и ПСС в полимерных микрокапсулах полиэлектролитов, кодируемых квантовыми точками, определяется их биосовместимостью и нетоксичностью, а также небиоразлагаемостью, что дополнительно помогает удерживать квантовые точки внутри оболочки. Биоразлагаемость поли-1-аргинина, поли-1-лизина, хитозана, натриевой соли альгиновой кислоты и сульфата декстрана, которые также широко используются в образовании полиэлектролитных микрокапсул, будет вызывать диффузию КТ из полимерной мембраны, что должно приводить к уменьшению флуоресцентных свойств микрочастиц [3, 11, 39, 48,49,50,51,52]. Поликатион ПАУ и полианион ПСС, использованные в данной работе, содержат, соответственно, аминные и сульфатные группы, обеспечивающие электростатическое взаимодействие между полимерными слоями, что приводит к образованию интерполимерных комплексов [16, 25, 36, 37]. Выбор первого полимерного слоя определялся величиной поверхностного заряда синтезированных микрочастиц карбоната кальция.

Процедура приготовления микрокапсул, кодированных квантовыми точками:формирование слоев поликатиона (1) и полианиона (2), полиэлектролитов ПАУ и ПСС соответственно на поверхности матрицы; кодирование полученных микрочастиц квантовыми точками и дальнейшее послойное нанесение полимеров (3); удаление сердцевины из карбоната кальция (4)

На рис. 4 представлены СЭМ-изображения стадий формирования полимерной оболочки на поверхности подложки. Как видно на микрофотографиях, микрочастицы содержали ядро ​​из зерен карбоната кальция и оболочку, которая становилась более отчетливой с увеличением количества адсорбированных полимерных слоев. Поверхность микрочастиц, покрытых слоями полиэлектролита, повторяла форму подложки с ее характерной однородностью, что позволяет предположить, что она также была пористой (рис. 4а, б) [44]. По мере того как полимерная оболочка становилась толще, поверхность микрочастиц становилась более ровной и гладкой (рис. 4c, d).

Сканирующая электронная микроскопия микрочастиц карбоната кальция после нанесения четырех ( a , b ) и десять ( c , d ) слои полиэлектролита

Заключительный этап приготовления микрокапсул из полиэлектролита, кодируемого квантовыми точками, включал удаление ядра карбоната кальция и формирование окончательной структуры микрокапсул. Для растворения матрицы, состоящей из зерен карбоната кальция, микрочастицы промывали ЭДТА. ЭДТА использовалась в первую очередь потому, что она образует водорастворимые комплексы при взаимодействии с солями двухвалентных металлов, включая кальций, а ее низкая молекулярная масса обеспечивает проницаемость полиэлектролитной оболочки для ЭДТА и ее комплексообразования с Ca ²⁺ . Это приводит к растворению ядра полиэлектролитных частиц и образованию полой структуры [45, 46].

Полученные нами микрочастицы с КТ и микрокапсулы полиэлектролита имели сферическую или почти сферическую форму и размер от 3,8 до 6,5 мкм (рис. 5). Анализ морфологии и структуры микрочастиц и микрокапсул в флуоресцентном режиме показал полости внутри микрокапсул из полиэлектролита, о чем свидетельствует их более высокая прозрачность по сравнению с микрочастицами (рис. 5b). Это продемонстрировало эффективность процедуры растворения ядра с помощью ЭДТА. Данные конфокальной микроскопии также показали полую структуру полученных флуоресцентных полиэлектролитных микрокапсул (рис. 6). Эти микрокапсулы можно разделить на отдельные частицы (рис. 6a, b), которые можно охарактеризовать как сферические частицы с шероховатой поверхностью из-за модификации их поверхности покрытием BSA.

Изображения флуоресцентной микроскопии микрочастиц карбоната кальция, покрытых полиэлектролитом и закодированных с помощью квантовой точки ( a ) и полученные из них полиэлектролитные микрокапсулы ( b )

Изображения с помощью конфокальной микроскопии микрокапсул из полиэлектролита, закодированных квантовыми точками и покрытых BSA:поперечные сечения микрокапсул ( a ); Трехмерная проекция одиночной микрокапсулы полиэлектролита ( b )

Оценка эффективности кодирования

Эффективность кодирования оценивалась по количеству КТ, адсорбированных на положительно заряженной полимерной поверхности микрочастицы. Оценка количества КТ в исходном растворе, используемом для кодирования микрочастиц, и в супернатанте до и после инкубации микрочастиц с раствором КТ, показала, что количество КТ, связанных с поверхностью микрочастиц, линейно увеличивается с увеличением содержания КТ в реакционной смеси от 0.36 to 2.241 mg (Fig. 7a). Further increase in the amount of QDs in the solution led to a decrease in the number of adsorbed QDs. This may have resulted from an insufficient density of the positive charge determined by amine groups of PAH on the microparticle surface because of an excessive amount of QDs and the resultant saturation of the surface with them. Apparently, the QDs were adsorbed more efficiently if their amount was smaller than 2.241 mg owing to sterically favorable conditions and less interference with one another’s attachment. The pattern of the dependence of the encoding efficiency on the QD content of the solution used for the encoding agrees with our earlier data [22].

Estimation of the efficiency of encoding of microparticles with different amounts of quantum dots (a ) and their fluorescence characteristics (b ). Asterisk indicates significant difference of QD-encoded microbeads from the QD-encoded microcapsules (p  < 0.05)

Estimation of the optical characteristics of the obtained polyelectrolyte microcapsules is an essential stage of the assessment of encoding efficiency. Its results show how suitable the given technique is for fabrication of imaging agents based on QD-encoded polyelectrolyte microcapsules.

Figure 7b shows the fluorescence intensities of the microparticles and microcapsules measured as the mean normalized intensity of gray color as dependent on the amount of QDs used for encoding them. As seen from the figure, the fluorescence intensity of the encoded microparticles was higher than that of the microcapsules obtained from them. At the same time, the microcapsules encoded with different amounts of QDs did not differ significantly from one another in fluorescence intensity (p> 0,05). Despite some decrease in the fluorescence intensity of the microcapsules, their encoding with the amount of QDs indicated above ensures a contrast sufficient for effective imaging.

Quantum Dot Fluorescence Lifetime within Encoded Polyelectrolyte Microcapsules

As noted above, the fluorescence intensity of the polyelectrolyte microcapsules was decreased compared to the microparticles used for their fabrication and encoded with the same QDs. Therefore, we have estimated the fluorescence lifetimes of both the original QDs and the same QDs embedded in the microparticles or the polymeric walls of the microcapsules.

The QD fluorescence kinetic curves (Fig. 8) are characterized by monoexponential dependence of fluorescent intensity on time according to the following equation:

Fluorescence lifetimes of the solubilized CdSe/ZnS quantum dots with a fluorescence peak at 590 nm incorporated in the fabricated microparticles and microcapsules

где I ( т ) is the intensity of QD fluorescence in response to excitation pulses and A ₁ , х , and t ₁ are parameters describing the change in the intensity with time.

We determined the fluorescence lifetime for each sample (Table 2). The original solubilized QDs had the longest fluorescence lifetime; it was decreased after the QDs were adsorbed onto the microparticles and incorporated into the structure of the polymer shell. This may have resulted from interaction between the QDs and PAH, as we found earlier [22]. In the case of microcapsules, the QD fluorescence lifetime tended to further decrease compared to the QDs within the microparticles from which the microcapsules were fabricated. A possible cause of this decrease was a technological factor entailed in the fabrication of microcapsules, namely, the dissolution of the core and the related increase in the necessary number of washings.

It should be noted, that the fluorescence lifetime also tended to decrease with time after the microcapsule fabrication. However, since 48 h after the microcapsule fabrication, further changes in the mean fluorescence lifetime were insignificant. The fluorescence decay was apparently caused by a decrease in the fluorescence quantum yield of QD embedded in the shells of the capsules. This effect is likely to have resulted from the change in the distribution of the electron potential and the geometric rearrangement of QDs in the inner layers of the polymer shell after the core removal that increased the probability of nonradiative recombination due to the charge transfer to between neighboring QDs or between QDs and polymer molecules [22].

Interaction of Quantum Dot- Encoded Polyelectrolyte Microcapsules with Phagocytic Cells In Vitro

We used confocal microscopy to analyze the interaction of QD-encoded polyelectrolyte microcapsules with live phagocytic cells, their uptake by cells, and the possibility of cell labeling. The murine alveolar macrophage (MH-S) cells were used as a model, because of the capability of these cells to phagocytize xenogenic objects.

The MH-S cells were treated with approximately 1.2×10 ⁶ of QD-encoded microcapsules by short-term (4 h) or long-term (24 h) incubations. We observed signs of primary uptake of the microcapsules in both cases:after the short- and (Fig. 9a–d) long-term incubation (Fig. 9e–h). Polyelectrolyte microcapsules or their conglomerates could be seen in green color. The microcapsules could be clearly distinguished both in the external environment of cells and inside the MH-S cells that could be evidenced by the distance between the microcapsules and nuclei of the MH-S cells which were stained by far-red DNA stain DRAQ5 and can be seen as red spherical shaped objects at all the microphotographs. As individual microcapsules and as their conglomerates were detected to undergo the uptake process. The fact that microcapsules were located in internal cell environment or at least attached to the surface of the macrophages is confirmed by clearly distinguished short distances between the nuclei and the polyelectrolyte microcapsules (Fig. 9b, d, g, h). In Fig. 9g, residually stained boundaries of the macrophage cytoplasmic membranes are distinctly seen, which indicates effective uptake, and well-discernible microcapsules are easy to detect to be attached on their surface either within the cells.

Confocal images of the MH-S cells treated with the QD-encoded polyelectrolyte microcapsules coated with BSA. The upper row shows the images of the samples after 4 h of short-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (a - г ). The lower row demonstrates the images of the samples after 24 h of long-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (e - ч ). The nuclei of the macrophages were counterstained with far-red DNA stain DRAQ5

During the short-term incubation, single microcapsules were found to be phagocytized by MH-S cells prior to conglomerates of the microparticles. While after long-term incubation (24 h), the amount of the conglomerates of the polyelectrolyte microcapsules undergoing the uptake process and located inside cells or at least attached to the cell surface was more significant than after short-term incubation. Thus, the polyelectrolyte microcapsules obtained in this study used as promising tools for imaging and tracking of live cells.

Conclusions

Our study has demonstrated the feasibility of fabrication of stable QD-encoded polyelectrolyte microcapsules with optimized fluorescence characteristics and a narrow size distribution. The technique for incorporation of water-soluble and stabilized with three-functional polyethylene glycol derivatives core/shell QDs into the polymer wall of the microcapsules and detailed characterization at each stage of experimental procedure ensured efficient fluorescent encoding of microcapsules. The efficient intracellular uptake of developed QD-encoded microcapsules by murine macrophages was demonstrated, thus confirming the possibility of efficient use of developed system for live cell imaging and visualization of microcapsules transportation and delivery within the living cells.

Сокращения

EDTA:

Disodium ethylenediaminetetraacetat

PAA:

Polyacrylic acid

PAH:

Polycation poly(allylamine hydrochloride)

PEG:

Polyethylene glycol

PSS:

Polyanion poly(sodium 4-styrenesulfonate)

QD:

Quantum dot

RPMI medium:

Roswell Park Memorial Institute medium

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

TOPO:

Оксид триоктилфосфина