Влияние pH липосом в микросреде на химическую стабильность загруженного лекарства

Фон

Липосома, искусственный мембранный носитель, продемонстрировала большой потенциал в доставке лекарств благодаря своей способности загружать лекарство, биоразлагаемости и биосовместимости [1,2,3,4]. Классические липосомы похожи по структуре на живые клетки, обычно состоящие из фосфолипидного бислоя и водной внутренней камеры [5,6,7]. Благодаря такой структуре липосомы способны солюбилизировать нерастворимые молекулы лекарства и предотвращать попадание загруженного лекарства в суровую физиологическую среду [8,9,10]. Кроме того, поверхность липосом можно модифицировать, чтобы продлить время циркуляции крови и / или воздействовать на определенные ткани [11,12,13,14,15]. Благодаря этим вышеупомянутым преимуществам, различные липосомные системы были клинически одобрены [8, 9, 16].

Хотя доставка многих лекарств была улучшена за счет включения в липосомы, доставка некоторых pH-чувствительных лекарств все еще ограничена нестабильностью самой молекулы лекарства в физиологической среде (нейтральные значения pH). Обычно липосомы готовят в нейтральном буферном растворе, и, таким образом, загруженные молекулы лекарственного средства также находятся в нейтральной среде после включения в липосомы. Соответственно, те молекулы, которые стабильны только в кислой среде, все еще будут нестабильными даже в форме липосом. Следовательно, разработка нового подхода к повышению стабильности pH-чувствительных лекарств имеет большое значение для успешной доставки этих полезных нагрузок липосомами.

Как упоминалось выше, липосома имеет водное пространство во внутренней камере, которое можно использовать для обеспечения лекарств в кислой микросреде (рис. 1). В данной работе мы используем куркумин в качестве модельного препарата и стремимся предложить новый подход для повышения химической стабильности молекул лекарства, загруженных в липосомы. Хорошо известно, что куркумин представляет собой липофильную молекулу и широко используется в продуктах питания, лекарствах и косметике из-за своей различной биоактивности [17,18,19,20,21]. Однако его доставка сильно ограничена его нерастворимостью и нестабильностью в биологических жидкостях [22,23,24,25]. Пока что он еще не выполнил свои клинические обещания отчасти из-за нестабильности, опосредованной pH [26]. Таким образом, куркумин - подходящий модельный препарат для этой работы.

Схема липосомы с различной кислотностью микроклимата в ее внутренней водной камере

Методы

Материалы

Фосфолипиды (соевый лецитин для инъекций) были приобретены в Shanghai Tai-Wei Pharmaceutical Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Холестерин был получен от Amresco (Солон, Огайо, США). Полоксамер 188 (F68) был любезно предоставлен BASF (China) Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Куркумин был поставлен компанией Sigma (Сент-Луис, Миссури, США). Фетальная бычья сыворотка (FBS) была приобретена у HyClone (Логан, Юта, США). Все остальные химические реагенты, использованные в этом исследовании, были аналитической чистоты или выше.

Приготовление липосом, содержащих куркумин (Cur-LP)

Липосомы с различными значениями pH в микросреде были приготовлены методом выпаривания в соответствии с предыдущими работами с некоторыми модификациями [27, 28]. Вкратце, фосфолипиды (75 мг) и холестерин (5 мг) растворяли в 0,5 мл этанола, содержащего 2 мг / мл куркумина. Раствор этанола смешивали с 5 мл 0,001 M PBS, содержащим 1% ( w / v ) F68, который служил поверхностно-активным веществом для сужения распределения по размерам. После магнитного перемешивания в течение 1 мин (магнитная мешалка с постоянной температурой, DF-101S, Zhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co., Ltd., Чжэнчжоу, Китай) полученную эмульсию выпаривали в вакууме и темноте в течение 30 мин при 35 ° C до удалить этанол. Кислотность во внутренней камере Cur-LP регулировали с помощью PBS с различными значениями pH 2,5, 5,0 или 7,4 во время приготовления. Полученную суспензию центрифугировали на низкой скорости (3000 об / мин, 5 мин) для осаждения свободного куркумина. Затем супернатант центрифугировали на высокой скорости (16 оборотов в минуту, 10 мин) и осадки ресуспендировали в PBS (pH 7,4) перед дальнейшим использованием. Эта процедура предоставила этим LP идентичную внешнюю среду. Полученные липосомы с различными значениями pH в микросреде были представлены как Cur-LP-2.5, Cur-LP-5.0 и Cur-LP-7.4 соответственно. Также были изготовлены пустые липосомы, как указано выше.

Характеристика липосом

Гидродинамический размер, распределение по размерам и дзета-потенциал - три основных параметра липосомных систем. Размер и дзета-потенциал LP определяли с помощью динамического рассеяния света (DLS) и электрофоретического рассеяния света (ELS), соответственно, с использованием ZetasizerNano ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Малверн, Великобритания) при 25 ° C [29]. Цикл измерения автоматически определялся приборной системой. Размер частиц был представлен распределением интенсивности, а распределение по размерам было оценено индексом полидисперсности (PDI).

Определение эффективности инкапсуляции (EE)

EE, важный параметр для контроля качества, имеет большое значение при разработке систем доставки на основе липосом. Определение EE было основано на методе высокоскоростного центрифугирования. Вкратце, 100 мкл Cur-LP центрифугировали на низкой скорости (3000 об / мин, 5 мин) для осаждения нерастворенного свободного куркумина, а 50 мкл супернатанта подвергали высокоскоростному центрифугированию (16 оборотов в минуту, 10 мин) для отделения Cur-LP. LP из крошечного растворенного куркумина. Осадки ресуспендировали в 500 мкл PBS (т.е. в 10-кратном разведении), аликвоту 10 мкл смешивали с 300 мкл этанола путем встряхивания и обработки ультразвуком в течение 30 с. Определяли интенсивность флуоресценции куркумина в полученном растворе (длина волны возбуждения (Ex), 458 нм; длина волны излучения (Em), 548 нм) и представляли как F _e , то есть интенсивность флуоресценции инкапсулированного куркумина. Еще 50 мкл свежего Cur-LP, содержащего инкапсулированный и свободный куркумин, также разбавляли в 10 раз PBS, и 10 мкл разбавленного раствора смешивали с 300 мкл этанола. Интенсивность флуоресценции полученного раствора была измерена и представлена ​​как F _т , то есть интенсивность флуоресценции всего куркумина. Таким образом, EE был рассчитан по следующему уравнению:EE = F _e / F _t .

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

Морфологию ЛП наблюдали с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM, INSPECT F, FEI, Нидерланды) [30]. Вкратце, суспензия LP была разбавлена ​​в 100 раз дистиллированной водой, и одна капля разбавленной суспензии была помещена на чистый стеклянный лист. После сушки на воздухе образец был покрыт золотом непосредственно перед SEM.

Физическая стабильность липосом

Физическая стабильность - очень важный параметр для хранения и транспортировки коллоидной системы. Физическая стабильность липосом была представлена ​​коллоидной стабильностью и исследована в соответствии с предыдущим методом [31]. Вкратце, 100 мкл LP добавляли в пробирки и хранили при 37 ° C. В различные интервалы времени измеряли размер LP и сравнивали с исходным размером, чтобы указать на термодинамическую стабильность. Кроме того, в пробирки добавляли еще 300 мкл LP и хранили при 37 ° C. В те же промежутки времени собирали 100 мкл жидкости верхнего слоя. Коэффициент пропускания собранных образцов измеряли при 550 нм и сравнивали с исходным значением, чтобы указать на кинетическую стабильность.

Версия In Vitro

Профиль высвобождения липосом играет важную роль в прогнозировании судьбы и эффективности липосом in vivo. Высвобождение куркумина из Cur-LP in vitro изучали с помощью метода динамического диализа [32]. Вкратце, 1 мл каждого Cur-LP добавляли в диализный мешок (отсечка по молекулярной массе, 10 кДа), который использовали для удержания липосом, но сохранения проницаемости высвобожденных молекул куркумина. Загруженный образцом диализный мешок пропитывали 4 мл высвобождающей среды (0,001 М PBS, содержащий 0,1% Твин 80, pH 7,4), и исследование высвобождения проводили вдали от света (37 ° C, 100 об / мин). Через каждый фиксированный интервал времени среду для высвобождения собирали и заменяли 4 мл свежей среды, чтобы имитировать условия погружения. Собранную среду разбавляли до 5 мл PBS и дополнительно разбавляли в 15 раз этанолом. Куркумин в полученном растворе определяли количественно с помощью флуоресцентной спектрофотометрии (Ex 458 нм, Em 548 нм). Кроме того, порошок куркумина растворяли в указанной выше среде для высвобождения, а высвобождение раствора куркумина проводили при pH 7,4, чтобы выяснить, удержит ли диализный мешок молекулы куркумина.

Химическая стабильность липосомального куркумина

Химическая стабильность - ключевой параметр для прогнозирования метаболизма, эффективности и токсичности лекарств. Химическую стабильность Cur-LP проверяли в 50% FBS. Вкратце, 100 мкл Cur-LP разбавляли в 10 раз PBS (pH 7,4), а затем смешивали с 1 мл FBS. Образцы встряхивали на горизонтальном встряхивателе вдали от света (37 ° C, 100 об / мин). Через фиксированные интервалы времени отбирали аликвоту 10 мкл образца и смешивали с 300 мкл этанола сразу после центрифугирования (16 оборотов в минуту, 5 мин). Оставшийся куркумин в супернатанте количественно определяли, как указано выше.

Противораковая эффективность in vitro

Предварительную противораковую эффективность трех Cur-LP исследовали с использованием клеток гепатоцеллюлярной карциномы печени человека HepG2. Вкратце, клетки HepG2 высевали на 96-луночные планшеты для культивирования клеток при плотности 10000 клеток на лунку и культивировали в стандартных условиях (37 ° C / 5% CO ₂ ) в течение 24 ч в культуральной среде PRIM-1640 с добавлением 10% FBS. Затем культуральную среду удаляли и клетки промывали PBS. Cur-LP разводили в бессывороточной культуральной среде (4 мкг / мл куркумина) и добавляли к клеткам с последующей непрерывной инкубацией в течение 1 и 3 дней при 37 ° C. Величину OD жизнеспособных клеток измеряли с помощью анализа cck-8. Клетки, обработанные пустой культуральной средой, служили контролем, а жизнеспособность клеток (%) представляла собой процентное значение оптической плотности образцов относительно контроля.

Статистика

Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (стандартное отклонение). Различия между двумя группами, проанализированные студентом t тест, считались статистически значимыми, когда p значение было меньше 0,05.

Результаты и обсуждение

Характеристика липосом

PH липосом в микросреде относится к кислотности во внутренней водной камере липосомы (рис. 1), которая отличается от pH внешней среды. В этой работе pH внешней среды всех липосомных суспензий составлял 7,4, если не указано иное.

Размер частиц, дзета-потенциал и эффективность инкапсуляции (EE) являются важными параметрами для контроля качества липосом. Размеры трех Cur-LP были похожи друг на друга (около 300 нм, рис. 2а). PDI каждого состава был ниже 0,2, что указывает на узкое распределение по размерам. Интересно, что отрицательный дзета-потенциал Cur-LP-7,4 (-9 мВ) значительно ниже, чем у двух других Cur-LP (~ -18 мВ). Обычно отрицательный дзета-потенциал будет уменьшаться и даже преобразовываться в положительное значение с уменьшением pH дисперсной фазы из-за увеличения H ⁺ концентрация. Мы действительно наблюдали это явление при приготовлении Cur-LP в небуферных растворах HCl / NaOH с pH 2,5, 5,0 и 7,4 (рис. 2b). Однако в случае PBS наличие PO ₄ ^3– , HPO ₄ ^2– , и / или H ₂ ЗП ₄ ^- и их взаимодействие с LP может привести к более сложным ситуациям и другим результатам. Хорошо известно, что дзета-потенциал играет ключевую роль в поддержании коллоидной стабильности наноразмерной суспензии. В общем, более высокое абсолютное значение дзета-потенциала приводит к более стабильной коллоидной суспензионной системе.

Физико-химическая характеристика липосом. а Гидродинамический размер и дзета-потенциал Cur-LP, изготовленных в PBS с pH 2,5, 5,0 и 7,4, соответственно. б Дзета-потенциал Cur-LP, изготовленных в растворах HCl / NaOH с pH 2,5, 5,0 и 7,4 соответственно. c Эффективность инкапсуляции Cur-LP, приготовленных в PBS. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3). Статистическая значимость между группами:*** p <0,001

ЭЭ вызывает беспокойство во время развития липосом. Обычно повышение энергоэффективности важно для снижения затрат и повышения эффективности. В этой работе ЭЭ Cur-LP-2.5 составляет 74% (рис. 2c), что является самым высоким среди Cur-LP-5.0 (45%) и Cur-LP-7.4 (64%), что указывает на то, что Cur- LP-2.5 - лучший препарат для доставки куркумина из точки EE. Причины разнообразия ЭЭ при разных значениях pH не очень ясны, но могут быть связаны с растворимостью куркумина, который растворим в щелочах или чрезвычайно кислых растворителях [33].

Морфология липосом, исследованная с помощью SEM, показана на фиг. 3. Частицы LP-2.5 (фиг. 3a) и LP-5.0 (фиг. 3b) имеют сферическую форму и равномерное распределение частиц. LP-7.4 также имеет сферическую форму, но можно четко наблюдать адгезию между частицами (рис. 3c), что указывает на то, что процесс сушки во время подготовки образца SEM приведет к агрегации LP-7.4. Это может быть связано с относительно низким абсолютным значением дзета-потенциала LP-7,4 (рис. 2а). Кроме того, размер частиц, измеренный с помощью SEM, меньше, чем гидродинамический размер, измеренный с помощью DLS, что связано с потерей гидратной оболочки липосом после процесса сушки для SEM.

СЭМ-изображения липосом с pH в микросреде a 2.5, б 5.0 и c 7.4. Шкала масштаба , 1 мкм

Физическая стабильность липосом

Липосома - это коллоидная система, и ее физическая стабильность может быть представлена ​​коллоидной стабильностью, которая оказывает существенное влияние на хранение липосом и их дальнейшее применение [34, 35]. Агрегация частиц (термодинамическая нестабильность) и осаждение (кинетическая нестабильность) являются двумя важными аспектами коллоидной нестабильности. Агрегация приводит к большему кажущемуся размеру, а седиментация приводит к изменению пропускания суспензии. Что еще более важно, увеличение размера может напрямую влиять на эффективность наносистем, поскольку было показано, что размер частиц оказывает большое влияние на клеточное поглощение, цитотоксичность, фармакокинетический профиль и распределение в тканях [36, 37].

Здесь мы исследовали агрегационные и седиментационные свойства трех липосомных систем, чтобы указать их термодинамическую и кинетическую стабильность, соответственно. Как показано на рис. 4а, три LP не показали существенных изменений гидродинамического размера в течение 72 часов, что указывает на то, что все эти LP обладают очень высокой термодинамической стабильностью. Между тем, изменение пропускания всех трех LP было менее 10% (рис. 4b), что указывает на небольшое осаждение частиц и, следовательно, на высокую кинетическую стабильность. Эти результаты свидетельствуют о том, что три LP обладают превосходной коллоидной стабильностью в течение 72 часов, а pH в микросреде не влияет на физическую стабильность липосом.

Физическая стабильность липосом с различными значениями pH среды (pH 2,5, 5,0 и 7,4). а Термодинамическая стабильность, указывающая на агрегацию частиц. б Кинетическая стабильность, указывающая на осаждение частиц. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3)

Версия In Vitro

Профиль высвобождения лекарственного средства из липосом обычно исследуется для оценки качества препарата, предоставления справочного материала для режима дозирования и прогнозирования эффективности in vivo. В общем, почти все липосомальные системы обладают свойством замедленного высвобождения лекарственного средства. Здесь мы исследовали поведение высвобождения in vitro трех Cur-LP в PBS (pH 7,4). Между тем, высвобождение раствора куркумина также исследовали, чтобы подтвердить, повлияет ли диализная мембрана на диффузию куркумина. Как показано на рис. 5а, куркумин очень быстро высвобождался из раствора (> 80% через 6 часов), что указывает на то, что диализный мешок не влиял на диффузию куркумина. В отличие от быстрого высвобождения раствора куркумина, все Cur-LP продемонстрировали очевидное свойство замедленного высвобождения (рис. 5b), а профили высвобождения были очень похожи друг на друга, что указывает на то, что pH в микросреде не оказывает значительного влияния на куркумин. скорость выпуска. В частности, куркумин высвобождался немного быстрее в первые 8 часов, вероятно, из-за первоначального всплеска высвобождения (совокупный процент высвобождения составлял около 5%). Через 8 часов куркумин высвобождался немного медленнее, и совокупный процент высвобождения составил ~ 30% в течение 72 часов. Предполагается, что скорость высвобождения in vivo или в присутствии сыворотки будет значительно выше, частично из-за метаболизма липидов.

Профили высвобождения in vitro различных составов куркумина в PBS (pH 7,4). а Раствор куркумина, в котором куркумин был растворен в PBS, содержащем 0,1% Tween 80 (pH 7,4). б Cur-LP с изменяющимся pH микроокружающей среды 2,5, 5,0 и 7,4 соответственно. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3)

Интересно, что профили выпуска всех трех Cur-LP близки к прямым. Поэтому была выполнена линейная подгонка к трем профилям высвобождения. Как показано в таблице 1, все эти профили показали очень хорошую линейность со степенью подгонки выше 0,99 (также отображаются уравнения регрессии), что позволяет предположить, что высвобождение Cur-LP соответствует кинетике нулевого порядка. В других подобных исследованиях было обнаружено, что высвобождение куркумина из липосом является нелинейным [38, 39]. С точки зрения исследований и разработок лекарств, кинетика высвобождения нулевого порядка является наиболее идеальным профилем высвобождения, поскольку она обеспечивает постоянную скорость высвобождения лекарственного средства и, таким образом, может поддерживать терапевтический эффект в течение длительного времени, сокращать время введения и уменьшать побочные эффекты. . Таким образом, LP, подготовленные в этой работе, могут быть перспективными носителями для контролируемой доставки лекарств.

Влияние pH в микросреде на химическую стабильность Cur-LP

Химическая стабильность липосомального куркумина в FBS показана на рис. 6. После инкубации в течение 2 часов 89% куркумина осталось для Cur-LP-2.5, значительно выше, чем 74% для Cur-LP-5.0 и 61% для Cur-LP. -7,4 ( п <0,001). Через 4 часа после инкубации 69% куркумина оставалось для Cur-LP-2.5, значительно выше, чем 53% для Cur-LP-5.0 и 40% для Cur-LP-7.4 ( p <0,01). Через 6 часов после инкубации 55% куркумина оставалось для Cur-LP-2.5, все еще значительно выше, чем 43% для Cur-LP-5.0 и 34% для Cur-LP-7.4 ( p <0,05). Понятно, что химическая стабильность Cur-LP зависит от pH микроокружающей среды:Cur-LP-2,5> Cur-LP-5,0> Cur-LP-7,4. Эта pH-зависимая химическая стабильность Cur-LP согласуется с другой работой, которая показала pH-зависимую стабильность свободного куркумина [26]. Высвобождение in vitro проводили в бессывороточной среде, и кумулятивное высвобождение могло составлять 30% через 72 часа. Однако исследование химической стабильности проводилось в растворе, содержащем сыворотку, в котором ферменты сыворотки могли разрушать высвобожденный куркумин, а также разрушать липосомы и, таким образом, разрушать невыделенный куркумин. Это причина того, что 30% куркумина было выделено через 72 часа в исследовании высвобождения in vitro, но только 55% оставалось через 6 часов для Cur-LP-2.5 в исследовании стабильности сыворотки.

Химическая стабильность липосомального куркумина (Cur-LP) при различных значениях pH в микроокружающей среде (pH 2,5, 5,0 и 7,4). Стабильность проверяли путем количественного определения оставшегося куркумина после инкубации Cur-LP с 50% FBS. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3). Статистическая значимость между группами:*** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05

Липосомы по своей структуре состоят из двух частей:одна представляет собой гидрофобный липидный бислой, а другая - гидрофильную внутреннюю водную камеру. Легко понять, что гидрофильное лекарство, чувствительное к pH, будет располагаться во внутренней водной камере, и на его стабильность будет существенно влиять pH микросреды в водной камере, где буферный объем и буферная способность будут намного выше. чем в липидном бислое. Напротив, куркумин является гидрофобной молекулой и может располагаться в липидном бислое. По этой причине довольно интересно выяснить химическую стабильность липосомального куркумина, зависящую от pH в окружающей среде. Предполагается, что пространство в липидном бислое не будет абсолютно безводным, хотя и гидрофобным. Как мы знаем, мембрана живой клетки не является абсолютно безводной по своему липидному бислою. Вместо этого он содержит небольшой объем водного раствора для транспорта водорастворимых молекул и ионов. Точно так же определенный небольшой объем буферного раствора с теми же компонентами, что и внутренняя камера, также будет существовать в гидрофобном липидном бислое после успешного приготовления липосом. Таким образом, гидрофобное лекарство, расположенное в липидном бислое, может напрямую зависеть от pH липосом в микросреде. Кроме того, кислая микросреда может снизить активность некоторых ферментов, которые проявляют лучшую активность в нормальном физиологическом состоянии. Это также способствует более высокой химической стабильности липосомального куркумина при более низком pH в микросреде. Сообщалось, что липосомы, состоящие из яичного фосфатидилхолина (EPC), быстро теряли свой внутренний градиент pH в буфере (pH 7,4), а способность поддерживать градиент pH была существенно усилена заменой EPC (температура фазового перехода ( T _м ) ≈ −5 ° C) с высокой T _м (41 ° C) липид DPPC (дипальмитоилфосфатидилхолин) и добавлением холестерина [40]. В данной работе липосома состоит из лецитина сои ( T _м составляет около 238,2 ° C [41]) и холестерина. Следовательно, можно ожидать, что градиент pH липосом в микросреде, приготовленный в этой работе, будет сохраняться в течение длительного периода. Это убедительно подтверждает результаты и предположения, представленные выше.

Противораковая эффективность in vitro

Выше мы продемонстрировали химическую стабильность липосомального куркумина, зависящую от pH в микроокружающей среде. Здесь мы провели предварительное исследование in vitro, чтобы изучить противораковую эффективность липосомального куркумина. Интересно, что пустые LP могут усиливать рост клеток на 1-й день и поддерживать эту функцию в некоторой степени до 3-го дня по сравнению с контрольной группой (рис. 7). Это указывает на то, что пустые LP могут обеспечивать питание клеток, что согласуется с нашим предыдущим отчетом [27]. Свободный куркумин показал небольшую противораковую эффективность из-за его довольно ограниченной растворимости. Напротив, Cur-LP продемонстрировали значительную противораковую эффективность в зависимости от pH в микросреде. После обработки в течение 1 дня Cur-LP-2.5 и Cur-LP-5.0 показали значительно более сильную способность ингибировать рост клеток HepG2, чем Cur-LP-7.4 (жизнеспособность клеток составляла 80% для Cur-LP-2.5 и Cur-LP. -5,0 и 90% для Cur-LP-7,4). На 3 день после обработки жизнеспособность клеток существенно снизилась, и Cur-LP-2.5 и Cur-LP-5.0 показали сравнимую противораковую эффективность и значительно выше, чем Cur-LP-7.4. Жизнеспособность клеток составляла 24% для Cur-LP-2.5 ( p <0,05 по сравнению с Cur-LP-7,4), 21% для Cur-LP-5,0 ( p <0,01 по сравнению с Cur-LP-7,4) и 39% для Cur-LP-7,4. Эти результаты показывают, что противоопухолевая эффективность липосомального куркумина зависит от pH и времени микроклимата. Принимая во внимание более высокую ЭЭ и химическую стабильность Cur-LP-2.5, чем Cur-LP-5.0, липосомы с pH в микросреде 2,5 будут иметь наибольший потенциал для практического применения.

Противораковая эффективность липосомального куркумина с различным pH микроокружающей среды (2,5, 5,0 и 7,4). Жизнеспособность клеток HepG2 в дни 1 и 3 после обработки пустыми LP, свободным куркумином и Cur-LP исследовали с помощью анализа cck-8. Клетки, обработанные пустой культуральной средой, содержащей сыворотку, служили контролем. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3). Статистическая значимость между группами:** p <0,01, * p <0,05