Ось MALAT1/miR-143/VEGFA управляет эндотелиальным повреждением, ведущим к внутричерепной аневризме

Аннотация

Роль некоторых длинных некодирующих РНК (lncRNA) внутричерепной аневризме (ИЧА) изучалась во многих исследованиях. Цель данного исследования — выяснить механизм сигнальной оси lncRNA MALAT1 (транскрипт 1, ассоциированный с метастазами легочной аденокарциномы) / микроРНК-143 (miR-143) / васкулярный эндотелиальный фактор роста-A (VEGFA) в ИЧА, индуцированной повреждением сосудистого эндотелия. Определяли экспрессию MALAT1, miR-143 и VEGFA в тканях ИЧА и нормальных артериальных тканях. Определяли матриксный металлопротеиназу-9 (MMP-9) в тканях, фактор фон Вилебранда (vWF) в сыворотке и тканях, эндотелин-1 (ET-1) в сыворотке. Моделируемым крысам с ИЧА вводили векторы с глушением или сверхэкспрессией MALAT1 для обнаружения эндотелиального повреждения. Сосудистые эндотелиальные клетки от пациентов с ИЧА изолировали и трансфицировали векторами с глушением или сверхэкспрессией MALAT1 для верификации влияния MALAT1 на жизнеспособность и апоптоз клеток. Связи между MALAT1, miR-143 и VEGFA верифицировали с помощью онлайн-предсказания, анализа люциферазной активности и RNA-pull down анализа. В тканях ИЧА обнаружили сверхэкспрессию MALAT1 и VEGFA и низкую экспрессию miR-143. Глушение MALAT1 снижало артериальное давление, экспрессию ET-1, vWF и MMP-9, а также апоптотический индекс сосудистых эндотелиальных клеток крыс с ИЧА. Глушение MALAT1 ингибировало апоптоз и стимулировало жизнеспособность сосудистых эндотелиальных клеток при ИЧА. MALAT1 связывался с miR-143, а miR-143 являлась мишенью для VEGFA. Данное исследование предполагает, что MALAT1 повышает экспрессию VEGFA через компетенсивное связывание miR-143, тем самым усиливая апоптоз и снижая жизнеспособность сосудистых эндотелиальных клеток при ИЧА.

Введение

Внутричерепная аневризма (ИЧА), также известная как церебральная аневризма, возникает из-за повышения внутричерепного давления, вызванного локальным аномальным расширением полости мозговой артерии или сосудистой стенки [1]. ИЧА — тяжелое заболевание с высокой смертностью и инвалидностью, превалентность составляет около 1–3% в общей популяции [2]. Основные клинические проявления ИЧА — церебральный вазоплазм, спонтанное داخلчерепное кровотечение и парез глазодвигательного нерва [3]. На данный момент основными факторами риска возникновения и прогрессирования ИЧА являются гемодинамические нарушения, генетика, старение, инфекции и врожденные факторы [4]. Основные клинические методы лечения — преимущественно хирургическое клиппирование и/или эндоваскулярное коилрование — направлены на профилактику разрыва аневризмы [5]. Однако детальный механизм, лежащий в основе ИЧА, до сих пор остается неясным, что отражает острую необходимость более эффективных методов управления ИЧА.

Длинные некодирующие РНК (lncRNA) имеют длину более 200 нуклеотидов и относятся к виду некодирующих РНК [6]. Сообщается, что экспрессия lncRNA, ассоциированной с арестом роста 1, в ИЧА понижена, а MALAT1 — высоко обогащенная и широко экспрессируемая lncRNA длиной около 8000 нт [7]. Документировано, что MALAT1 модулирует дисфункцию гладкомышечных клеток при аневризме грудного участка аорты [8]. Также исследование представило аномальную экспрессию lncRNA и мРНК при ИЧА, а сети коэкспрессии lncRNA-мРНК дают подсказки для выявления патогенеза ИЧА [9]. Показано, что MALAT1 стимулирует экспрессию остерикса и модулирует остеогенное дифференцирование через таргетирование экспрессии miR-143 в человеческих мезенхимальных стволовых клетках костного мозга [10]. Исследование также представило роль кластера miR-143/145 в обратной регуляции фактора Крюппеля 5 в гладкомышечных клетках и их сократимости и пролиферации при ИЧА [11]. Согласно Feng и соавт., порегуляция miR-143/145 и повышенный уровень MMP-9 при циркуляции могут быть связаны с формированием и разрывом ИЧА [12]. Анализ كشف, что наиболее дезорганизованные микроРНК (miR-143 и miR-145) являются общими для целевых генов, являющихся сигнальными путями, такими как васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF), и другими генами, регулирующими клеточное движение или адгезию [13]. Исследование раскрыло предиктивную важность вариаций VEGFA при ИЧА [14]. Поэтому мы стремились оценить механизм сигнальной оси MALAT1/miR-143/VEGFA при ИЧА, индуцированной повреждением сосудистого эндотелия.

Материалы и методы

Этическое заявление

Исследование одобрено Этического комитетом Первой аффилированной больницы USTC, Отделения наук о жизни и медицины, Университета науки и технологий Китая и соответствовало положениям Декларации Хельсинки. Участники предоставили письменное информированное согласие. Все эксперименты на животных соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол разрешен Комитетом по этике экспериментов на животных Первой аффилированной больницы USTC, Отделения наук о жизни и медицины, Университета науки и технологий Китая.

Объекты исследования

Для экспериментов отобрали 20 пациентов с ИЧА (группа ИЧА), у которых диагноз был подтвержден методами визуализации и которые проходили нейрохирургическое клиппирование в Первой аффилированной больнице USTC, Отделении наук о жизни и медицины, Университета науки и технологий Китая. Было 11 мужчин и 9 женщин в возрасте 43,27 ± 6,25 лет. Брали образцы тканей ИЧА. Одновременно у 20 пациентов (контрольная группа) с височной долей эпилепсии, вызванной склерозом миндалевидного тела и гиппокампа, ресектировали височные корковые сосудистые ткани от височного полюса. Ресецированные ткани гистопатологически подтверждались как нормальные артериальные ткани после операции; было 13 мужчин и 7 женщин в возрасте 44,18 ± 5,91 лет. Значимых различий в половом и возрастном составе между группой ИЧА и контрольной группой не выявлено (оба P > 0,05). Вениозные образцы крови (2 пробирки) получали от всех испытуемых натощак в одно и то же время утром перед операцией.

Создание моделей ИЧА на крысах

60 чистых самцов крыс линии Sprague-Dawley (Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd., Хунань, Китай), весом 200–250 г, выращивали 7 дней (25 ± 2 °C, относительная влажность 65–70%, 12-часовой световой цикл, свободный доступ к воде и корму). Крысам вводили суиной поджелудочную эласту в наружную сонную артерию и в область бифуркации сосудистой стенки. Наружную сонную артерию перевязывали двумя хирургическими нитями на ветви наружной сонной артерии примерно в 1,5 мм. Наружную сонную артерию перерезали между двумя нитями для формирования внутричерепной аневризмы в слепом сегменте наружной сонной артерии. Крыс кормили 1% физраствором в течение 1 недели после операции. Через 1 месяц проводили церебральную ангиографию и наблюдали формирование аневризмы.

После создания моделей ИЧА на крысах 50 крыс случайным образом распределили на 5 групп: контрольная группа (n = 10, смоделированные крысы получали стереотактическую инъекцию 100 мкл фосфатно-буферного раствора (PBS) раз в сутки), группа sh-NC (n = 10, смоделированные крысы получали стереотактическую инъекцию 100 мкл ш-MALAT1 NC раз в сутки), группа sh-MALAT1 (n = 10, смоделированные крысы получали стереотактическую инъекцию 100 мкл плазмиды ш-MALAT1 раз в сутки), группа Oe-NC (n = 10, смоделированные крысы получали стереотактическую инъекцию 100 мкл плазмиды Oe-MALAT1 NC раз в сутки) и группа Oe-MALAT1 (n = 10, смоделированные крысы получали стереотактическую инъекцию 100 мкл плазмиды Oe-MALAT1 раз в сутки) [15]. Вышеуказанные плазмиды были составлены Shanghai Genechem Co., Ltd. (Шанхай, Китай).

Измерение артериального давления крыс

Артериальное давление хвостовой артерии крыс измеряли на 1-й, 4-й и 12-й неделях после операции. Перед измерением крыс помещали в термостат на некоторое время для предотвращения влияния внешней температуры. Затем крыс держали в спокойствии несколько минут в специальной клетке для предотвращения влияния активности. Если артериальное давление сильно варировало, измерение повторяли 2–3 раза в разное время для получения среднего значения.

Получение тканей аневризмы

Через 3 месяца крыс анестезировали 1% натрия пентобарбитала (40 мг/кг) внутрибрюшинно для получения крови из вен. Крыс эвтаназировали, открывали грудную клетку, интюбировали левый желудочек в аорту, перерезавали полую вену для выпуска крови. Одновременно 30 мл физраствора с гепарином натриевым использовали для быстрой сердечной перфузии для промывки крови, затем вводили 10 мл 10% полиформальдегида/0,1 М PBS (pH 7,4) в мозг. После перфузии и фиксации открывали мозг крысы. Тщательно осматривали артериальное кровообращение в основании черепа, отделяли ткань аневризмы и наблюдали изменения аневризмы под микроскопом.

Иммуноферментный анализ (ELISA)

Сывороточные индексы определяли наборами ELISA. Собранные образцы крови помещали в термостат при 37 °C на 1 час и центрифугировали на 3000 об/мин в течение 10 мин. Определение экспрессии эндотелина-1 (ET-1) и фактора фон Вилебранда (vWF) проводили согласно инструкции к наборам (все наборы приобретены в NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Цзянсу, Китай).

Гемоксилин-эозиновое (ГЭ) окрашивание

Образцы фиксировали в 10% формалине более 24 часов и консервировали в парафиновых блоках. Парафиновые блоки депарафинизировали ксилолом 20 мин, обезвоживали по нисходящей градиентной серии спиртов (100%, 95%, 80%, 75%) по 1 мин, окрашивали гемоксилином 10 мин. Затем ткани промывали дистиллированной водой, дифференцировали спиртом с соляной кислотой 30 сек, мацерировали в теплой воде (50 °C) 5 мин. Окрашивали эозином, промывали дистиллированной водой, обезвоживали 70% и 90% спиртами, прокачивали ксилолом и закрепляли нейтральным каучуком. Морфологию тканей наблюдали под высокоразрешающим микроскопом.

Наблюдение передаточным электронным микроскопом

Резервные ткани фиксировали в 2,5% глутаровом диальдегиде и 1% осмиевой кислоте, обезвоживали и инклудировали в смолу Epon812. Полутонкие срезы окрашивали синим толуидом, подстригали и делали ультратонкие срезы. Срезы окрашивали уранилом-ацетатом и цитратом свинца и наблюдали на передаточном электронном микроскопе JME-2000EX (Hitachi High-Technologies Co., Ltd., Шанхай, Китай).

TUNEL-окрашивание

TUNEL-окрашивание использовали для наблюдения апоптоза эндотелиальных клеток у крыс с ИЧА на основе набора TUNEL (Roche, Базель, Швейцария). Подготовленные срезы аневризмы крыс промывали дважды ксилолом (5 мин/раз) и обезвоживали по нисходящей серии спиртов (100%, 95%, 80%, 75%) 3 раза (5 мин/раз). Ткани обрабатывали раствором протеазы K 20 мкг/мл без DNазы 15–30 мин, наносили 50 мкл реактивного раствора TUNEL на 60 мин, развивали 50 мкл диаминобензидина (DAB) при 25 °C 10 мин. Затем срезы контрастировали гемоксилином, обезвоживали градиентными спиртами, прокачивали ксилолом и закрепляли нейтральным каучуком. Срезы наблюдали под оптическим микроскопом и вычисляли апоптотический индекс.

Изоляция и идентификация эндотелиальных клеток аневризмы

Изоляция эндотелиальных клеток проводили по методу Boscolo и соавт. [16]. Ткани ИЧА сечение на фрагменты 3 мм². Ткани инкубировали с 0,1% коллагеназы B / 0,1% диспазы (Roche) 25 мин при 37 °C. Затем предварительно отслоенные ткани гомогенизировали 2 мин пипеткой 2 мл и фильтровали через ситечко 100 мкм (Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, США). Затем клеточную суспензию центрифугировали и ресуспендировали в среде MV2 (включающей факторы роста и 20% эмбриональной бычьей сыворотки) (PromoCell, Хайдельберг, Германия). Клетки посеяли при плотности 1 × 10⁴ клеток/мл в колбу для культивирования, покрытую фибronectinом 1 мкг/см². Следуя методу, описанному Jackson и соавт. [17], клетки при конфлюэнтности 80–100% отделяли с помощью бидов (Dynabeads M-450 Tosylactivated, Oxoid, Хэмпшир, Великобритания), покрытых Ulex europaeus Agglutinin I (UEA) (Vector Laboratories, Ltd., Питерборо, Великобритания). Эндотелиальные клетки, адгерировавшие к лектино-покрытым бидам, собирали с помощью магнитного концентратора частиц, а неконъюгированные клетки промывали базальной средой. UEA-позитивные клетки ресуспендировали в культурной среде и посеяли в колбу для культивирования, покрытую фибronectinом, для улучшения адгезии и скорости роста клеток.

Клетки выращивали в среде MV2 на фибronectin-покрытых камерных стеклах. Когда конфлюэнтность клеток достигала 80–100%, клетки фиксировали в ацетоне при 4 °C и обрабатывали 1% Triton X-100 в течение 5 мин, затем 0,5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) 15 мин. Клетки капали первичным антителом к vWF (1:300, Abcam, Кембридж, США) и инкубировали 2 ч (контроль проводили в отсутствии первичного антитела), капали конъюгированным с пероксидазом иммуноглобулином G (1:150, Abcam) и инкубировали 30 мин. Затем клетки развивали 50 мкл DAB при 25 °C 5 мин, контрастировали гемоксилином, дифференцировали 0,1% соляной кислотой, обезвоживали спиртом, прокачивали ксилолом и закрепляли нейтральным каучуком. После сушки фотографировали клетки под инвертированным микроскопом.

Группировка клеток и трансфекция

Эндотелиальные клетки аневризмы в логарифмической фазе распределяли на 5 групп: контрольная группа (эндотелиальные клетки аневризмы без обработки), группа sh-NC (трансфицированные плазмидой ш-MALAT1 NC), группа ш-MALAT1 (трансфицированные плазмидой ш-MALAT1), группа Oe-NC (трансфицированные плазмидой Oe-MALAT1 NC) и группа Oe-MALAT1 (трансфицированные плазмидой Oe-MALAT1). Вышеуказанные плазмиды синтезировала Genechem. Трансфекцию клеток проводили согласно инструкции реагента lipofectamine^TM 2000 (11668-027, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США).

MTT-анализ

Эндотелиальные клетки каждой группы посеяли в 96-колодчатую пластинку при плотности 3 × 10⁴ клеток/мл и культивировали при 37 °C, 5% CO₂ в течение 48 ч. В каждой группе устанавливали 5 параллельных колодок, в каждую добавляли 20 мкл свежего раствора MTT (5 мг/мл, Sigma, Сент-Луис, США). После 4-часовой реакции клетки смешивали с 200 мкл диметилсульфоксида. После полного растворения оптическую плотность клеток в каждой группе измеряли фотометром для микропластинок (BioRad, Херкулес, Калифорния, США) при 490 нм.

Поточная цитометрия

Распределение по фазам клеточного цикла тестировали окрашиванием йодидом пропидия (PI). Эндотелиальные клетки отщепляли, центрифугировали, ресуспендировали в предохлажденном 75% этаноле и фиксировалиovernight при −20 °C. Клетки центрифугировали для удаления супернатанта. Клетки ресуспендировали в 450 мкл PBS, добавляли 100 мкл РНазы А и окрашивали 400 мкл PI при 4 °C 30 мин в темноте. Для анализа распределения по фазам клеточного цикла использовали потоку cytometry (FACSCalibur, Becton, Dickinson and Company, NJ, США).

Апоптоз клеток тестировали двойным окрашиванием Annexin V/PI. Отщёпленные эндотелиальные клетки собирали и промывали PBS 3 раза. Клетки ресуспендировали в 100 мкл предохлажденного 1× связывающего буфера и смешивали с 5 мкл Annexin и 5 мкл PI соответственно. Апоптоз клеток анализировали потоку cytometry. С Annexin V как абсциссой и PI как ординатой: левый верхний квадрант — механически поврежденные клетки (AnnexinV⁻/PI⁺), правый верхний — поздние апоптотические или некротические клетки (AnnexinV⁺/PI⁺), левый нижний — нормальные отрицательные клетки (AnnexinV⁻/PI⁻), правый нижний — ранние апоптотические клетки (AnnexinV⁺/PI⁻). Общее количество апоптотических клеток (AnnexinV⁺/PI⁻ и AnnexinV⁺/PI⁺) вычисляли и выражали в процентах.

Обратная транскрипция и количественный ПЦР (RT-qPCR)

Общие РНК в тканях и клетках извлекали тризолем (Takara Biotechnology Ltd., Далянь, Китай), концентрацию и чистоту РНК определяли. Процесс обратной транскрипции РНК в комплементарную ДНК проводили согласно инструкции набора для обратной транскрипции (K1621, Fermentas, Мэриленд, США). Праймерные последовательности MALAT1, miR-143 и VEGFA (таблица 1) разрабатывала и синтезировала Genechem. Для оценки экспрессии lncRNA, микроРНК или мРНК проводили RT-qPCR с использованием SYBR Green PCR Master Mix (Takara, Токио, Япония) на системе Real-Time PCR Roche (Roche). U6 использовали как внутренний стандарт для miR-143, а для MALAT1 и VEGFA — глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH). Относительные уровни транскрипции целевых генов вычисляли методом 2^−ΔΔCt.

Анализ вестерн-блотингом

Общий белок из тканей и клеток извлекали. Концентрацию белка определяли по инструкции набора бинхониновой кислоты (Boster Biological Technology Co. Ltd., Ухань, Хубэй, Китай). Белок разделяли электрофорезом в 10% полиакриламидном геле (Boster Biological Technology). Переносили мембрану на поливинилиденфторидную мембрану и блокировали 5% BSA 1 час. Инкубировали мембрану с первичными антителами против Ki-67 (1:1000), VEGFA (1:1000), vWF (1:1000), матриксного металлопротеиназы (MMP)-9 (1:1000, Abcam, Кембридж, Великобритания), Циклин D1 (1:1000), Bax (1:1000), Bcl-2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния, США) и GAPDH (1:2000, Jackson Immuno Research, Гроув, Пенсильвания, США), а также со вторичным антителом (1:500, Jackson Immuno Research), маркированным пероксидазом коневой радикали. Мембрану визуализировали системой двухцветного инфракрасного флуоресцентного сканирования Odyssey, серые значения полос измеряли программой Quantity One для анализа изображений.

Анализ двойной люциферазной репортерной системы

Места связывания MALAT1 и miR-143 предсказывали и интерпретировали на биоинформатическом сайте (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/). Связывающие отношения между MALAT1 и miR-143 дополнительно верифицировали анализом люциферазной репортерной системы. Синтетический фрагмент гена 3′непереводимой области (3′UTR) MALAT1 вводили в векторы люциферазных репортеров pmiR-Report (Thermo Fisher Scientific) для генерации MALAT1 wild-type (MALAT1-WT) с помощью рестрикционных мест Bamh1 и Ecor1. Комплементарную мутацию последовательности вводили в MALAT1-WT, и целевой фрагмент вставляли в векторы люциферазных репортеров pmiR-Report для получения MALAT1 mutant-type (MALAT1-MUT) с помощью Т4 ДНК-лигазы после рестрикционного гидролиза. Правильно секвенированные MALAT1-WT и MALAT1-MUT ко-трансфицировали с mimic NC и miR-143 mimic в эндотелиальные клетки. Клетки собирали и лизировали через 48 часов после трансфекции, люциферазную активность измеряли набором для определения люциферазы (BioVision, Сан-Франциско, США) с люминометром (Glomax20/20, Promega, Мэдисон, Висконсин, США).

Целевые отношения miR-143 и VEGFA и место связывания miR-143 и 3′UTR VEGFA предсказывали через биоинформатический сайт (https://www.targetscan.org/vert_72/). Последовательность промоторной области 3′UTR VEGFA, содержащая место связывания miR-143, синтезировали и клонировали в векторы люциферазных репортеров pmiR-Report для генерации VEGFA-WT. На основе этого репортера место связывания VEGFA-WT и miR-143 мутировали для формирования VEGFA-MUT. Репортер VEGFA-WT или VEGFA-MUT смешивали с mimic NC или miR-143 mimic и ко-трансфицировали в эндотелиальные клетки на 48 часов. После этого клетки лизировали и люциферазную активность измеряли набором для определения люциферазы.

RNA-pull down анализ

Для верификации связывающих отношений между miR-143 и MALAT1 실시ли RNA-pull down анализ. Три биотинированные микроРНК-последовательности Bio-miR-143-WT, Bio-miR-143-MUT и Bio-miR-NC разработали и поручили компании GenePharma (Шанхай, Китай). Эти биотинированные олигонуклеотиды трансфицировали в клетки на 48 часов. Затем клетки собирали и инкубировали с специфическим лизисным буфером (Ambion, Остин, Техас, США) 10 мин. После этого лизис инкубировали с бидами M-280 стрептавидина, предварительно покрытыми RNase-free и дрожжевой тРНК (все от Sigma) при 4 °C 3 часа, затем промывали дважды холодным лизисным раствором, трижды буфером с низкой соляностью и один раз буфером с высокой соляностью. Антагонистический зонд miR-143 устанавливали как контроль. Общую РНК извлекали тризолем, а затем уровень обогащения MALAT1 определяли RT-qPCR.

Статистический анализ

Все данные обрабатывали программой SPSS 21.0 (IBM Corp., Армонк, Нью-Йорк, США). Измерительные данные представляли как среднее ± стандартное отклонение. Сравнения между двумя группами проводили независимым t-тестом Стьюдента, сравнения среди множества групп — однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA), попарные сравнения — тестом Тьюки. Связь между экспрессией MALAT1 и клиникопатологическими признаками ИЧА определяли хи-квадрат тестом. P < 0,05 указывало на статистически значимую разницу.

Результаты

MALAT1 и VEGFA сверхэкспрессированы, а miR-143 порегулирован в тканях ИЧА

Экспрессию ET-1 и vWF в сыворотке в группе ИЧА и контрольной группе определяли методом ELISA, результаты показали, что экспрессия ET-1 и vWF увеличилась в группе ИЧА по сравнению с контрольной (оба P < 0,05) (рис. 1a, b).

MALAT1 и VEGFA сверхэкспрессированы, а miR-143 порегулирован в тканях ИЧА. a Экспрессия ET-1 в сыворотке пациентов с ИЧА и пациентов с височной долей эпилепсии методом ELISA. b Экспрессия vWF в сыворотке пациентов с ИЧА и пациентов с височной долей эпилепсии методом ELISA. c Патологическое наблюдение тканей ИЧА и нормальных артериальных тканей ГЭ-окрашиванием. d Морфологическое наблюдение тканей ИЧА и нормальных артериальных тканей передаточным электронным микроскопом. e Экспрессия мРНК MALAT1, miR-143 и VEGFA в тканях ИЧА и нормальных артериальных тканях методом RT-qPCR. f Белковая экспрессия VEGFA, MMP-9 и vWF в тканях ИЧА и нормальных артериальных тканях методом вестерн-блоттинга. Эндотелиальные клетки (EC), внутренняя эластическая пластинка (IEL), гладкомышечные клетки (SMC). Измерительные данные изображены как среднее ± стандартное отклонение; сравнения между группами проводили независимым t-тестом

Патологические изменения тканей ИЧА наблюдали через ГЭ-окрашивание. В нормальных артериальных тканях не наблюдалось явного повреждения эндотелия, эндотелиальных клеток и гладкомышечных клеток, клетки были упорядочены аккуратно и имели целую структуру. Ткани ИЧА демонстрировали поврежденные эндотелиальные клетки, дегенерированные гладкомышечные клетки, утонченную сосудистую стенку, разорванные эластические волокна и инфильтрированные воспалительные клетки (рис. 1c).

Ультразструктурные изменения тканей ИЧА и нормальных артериальных тканей наблюдали передаточным электронным микроскопом. В нормальных артериальных тканях эндотелиальные клетки были целыми, структура адвентиции неповреждена; не видели разрывов внутренней эластической мембраны или апоптотических гладкомышечных клеток. В тканях ИЧА наблюдалась тяжелая дегенерация сосудистой стенки, проявляющаяся в исчезновении большинства эндотелиальных клеток, тяжелом разрыве внутреннего эластического слоя, тяжелом повреждении и деградации гладкомышечных клеток и нарушении внешней оболочки сосуда (рис. 1d).

RT-qPCR проводили для определения экспрессии мРНК MALAT1, miR-143 и VEGFA, а вестерн-блоттинг — для белковой экспрессии VEGFA, MMP-9 и vWF в тканях ИЧА и нормальных артериальных тканях. Показали, что в противовес нормальным артериальным тканям, экспрессия MALAT1, VEGFA, MMP-9 и vWF была повышена, а экспрессия miR-143 — понижена в тканях ИЧА (все P < 0,05) (рис. 1e, f).

Степень по по шкале Hunt-Hess, степень эндотелиального повреждения и история курения коррелируют с экспрессией MALAT1 в тканях ИЧА

Основываясь на медианной экспрессии MALAT1, пациентов разделили на две группы: группу с низкой экспрессией и группу с высокой экспрессией. Анализировали связь между экспрессией MALAT1 и клиникопатологическими признаками пациентов с ИЧА. Результаты указали, что степень по шкале Hunt-Hess, степень эндотелиального повреждения и история курения ассоциированы с экспрессией MALAT1 (все P < 0,05), в то время как возраст, пол и хирургический метод не связаны с экспрессией MALAT1 (все P > 0,05) (таблица 2).

Глушение MALAT1 подавляет артериальное давление, экспрессию ET-1, vWF и MMP-9, а также апоптотический индекс сосудистых эндотелиальных клеток крыс с ИЧА

Как показано в таблице 3, глушение MALAT1 снижало, а сверхэкспрессия MALAT1 повышала артериальное давление на 4-й и 12-й неделях.

ELISA показал, что порегуляция MALAT1 снижала, а упрегуляция MALAT1 повышала экспрессию ET-1 и vWF в сыворотке крыс с ИЧА (рис. 2a, b).

Глушение MALAT1 подавляет артериальное давление, экспрессию ET-1, vWF и MMP-9, а также апоптотический индекс сосудистых эндотелиальных клеток крыс с ИЧА. a Экспрессия ET-1 в сыворотке крыс методом ELISA. b Экспрессия vWF в сыворотке крыс методом ELISA. c Патологические изменения тканей ИЧА у крыс ГЭ-окрашиванием. d Ультразструктура тканей ИЧА у крыс передаточным электронным микроскопом. e Апоптоз сосудистых эндотелиальных клеток TUNEL-окрашиванием. f Апоптотический индекс сосудистых эндотелиальных клеток крыс. g Экспрессия мРНК MALAT1, miR-143 и VEGFA в тканях ИЧА крыс методом RT-qPCR. h Белковая экспрессия VEGFA, MMP-9 и vWF в тканях ИЧА крыс методом вестерн-блоттинга. * P < 0,05 vs. группа sh-NC, # P < 0,05 vs. группа Oe-NC. Измерительные данные изображены как среднее ± стандартное отклонение, сравнения среди множества групп оценивали однофакторным ANOVA с последующим тестом Тьюки

Патологические изменения тканей ИЧА в каждой группе изучали ГЭ-окрашиванием. Контрольная группа, группа sh-NC и группа Oe-NC демонстрировали поврежденную внутреннюю мембрану, эксфолиацию эндотелиальных клеток, дегенерацию гладкомышечных клеток, уменьшение клеток и слоев, утончение артериальной стенки. В группе sh-MALAT1 эндотеlium, эндотелиальные клетки, слой гладкомышечных клеток и внешний мембранный слой внутричерепной артерии были слегка повреждены, но упорядочены аккуратно. Группа Oe-MALAT1 показывала исчезнувший интимальный слой, эксфолиацию эндотелиальных клеток, разрыв эластических волокон и инфильтрацию воспалительных клеток (рис. 2c).

Ткани ИЧА крыс в каждой группе наблюдали передаточным электронным микроскопом. Показали, что в контрольной группе, группе sh-NC и группе Oe-NC представлены денатюрированные эндотелиальные клетки, дезинтегрированный подэндотелиальный слой, исчезнувший внутренний эластический слой и уменьшенные гладкомышечные клетки. Группа sh-MALAT1 демонстрировала плоские эндотелиальные клетки, овальные ядра и увеличенные коллагеновые волокна, но без эластического слоя. Группа Oe-MALAT1 характеризовалась исчезнувшими эндотелиальными клетками и отделенным эластическим слоем от мышечного слоя, который дезинтегрировал в просвет (рис. 2d).

Апоптотический индекс сосудистых эндотелиальных клеток у крыс с ИЧА тестировали TUNEL-окрашиванием. Глушение MALAT1 снижало апоптотический индекс сосудистых эндотелиальных клеток, тогда как сверхэкспрессия MALAT1 оказывала противоположный эффект (рис. 2e, f).

RT-qPCR определения экспрессии мРНК MALAT1, miR-143 и VEGFA, и вестерн-блоттинг белковой экспрессии VEGFA, MMP-9 и vWF в тканях ИЧА показали, что элиминация MALAT1 подавляла экспрессию MALAT1, VEGFA, MMP-9 и vWF, и повышала экспрессию miR-143. Напротив, повышение MALAT1 оказывало противоположное влияние на экспрессию этих генов (рис. 2g, h).

Низкая экспрессия MALAT1 повышает жизнеспособность и подавляет апоптоз сосудистых эндотелиальных клеток при ИЧА

Иммуногистохимическое окрашивание использовали для обнаружения экспрессии эндотелиально-специфического маркера vWF. Показали, что цитоплазма эндотелиальных клеток ИЧА покрыта мелкими коричневатыми гранулами, что было положительным, в то время как цитоплазма в контрольной группе не имела коричневатых гранул. Результаты подтвердили, что культивированные клетки были эндотелиальными клетками (рис. 3a, b).

Низкая экспрессия MALAT1 повышает жизнеспособность и подавляет апоптоз сосудистых эндотелиальных клеток при ИЧА. a Иммуногистохимическое окрашивание vWF в эндотелиальных клетках ИЧА: эндотелиальные клетки ИЧА покрыты мелкими желтыми частицами. b Иммуногистохимическое окрашивание vWF в эндотелиальных клетках ИЧА: эндотелиальные клетки ИЧА не показывали коричневатых частиц в контрольной группе. c Жизнеспособность эндотелиальных клеток в каждой группе MTT-анализом. d Белковая экспрессия ЦиклинD1 и Ki-67 в каждой группе вестерн-блоттингом. e Изменения клеточного цикла в каждой группе PI-окрашиванием. f Скорость апоптоза клеток в каждой группе двойным окрашиванием Annexin V/PI. g Белковая экспрессия Bax и Bcl-2 в каждой группе вестерн-блоттингом. * P < 0,05 vs. группа sh-NC, # P < 0,05 vs. группа Oe-NC. Измерительные данные изображены как среднее ± стандартное отклонение, сравнения среди множества групп оценивали однофакторным ANOVA с последующим тестом Тьюки

MTT-анализ, потоку cytometry и вестерн-блоттинг использовали для тестирования жизнеспособности и апоптоза эндотелиальных клеток. Показали, что уменьшение MALAT1 способствовало жизнеспособности эндотелиальных клеток (повышала экспрессию Циклин D1 и Ki-67) и подавляло апоптоз (уменьшала клетки в фазе G0/G1 и увеличивала клетки в фазах S и G2/M, снижала экспрессию Bax и повышала экспрессию Bcl-2). Однако сверхэкспрессия MALAT1 функционировала противоположным образом по сравнению с уменьшением MALAT1 на жизнеспособности и апоптозе клеток (рис. 3c–g).

miR-143 связывается с MALAT1, а VEGFA является целевым геном miR-143

Экспрессию MALAT1, miR-143 и VEGFA в эндотелиальных клетках каждой группы верифицировали через RT-qPCR и вестерн-блоттинг. Результаты показали, что глушение MALAT1 подавляло экспрессию MALAT1 и VEGFA и повышало экспрессию miR-143. Напротив, упрегуляция MALAT1 приводила к увеличению экспрессии MALAT1 и VEGFA и снижению экспрессии miR-143 (рис. 4a, b).

miR-143 связывается с MALAT1, а VEGFA является целевым геном miR-143. a Экспрессия мРНК MALAT1, miR-143 и VEGFA в эндотелиальных клетках аневризмы в каждой группе. b Белковая экспрессия VEGFA в эндотелиальных клетках аневризмы в каждой группе. c Места связывания MALAT1 и miR-143, предсказанные биоинформатическим сайтом. d Регуляторные отношения MALAT1 и miR-143, верифицированные анализом двойной люциферазной репортерной системы. e Связывающие отношения между MALAT1 и miR-143, верифицированные RNA-pull down анализом. f Места связывания miR-143 и VEGFA, предсказанные биоинформатическим сайтом. g Регуляторные отношения miR-143 и VEGFA, верифицированные анализом двойной люциферазной репортерной системы. * P < 0,05 vs. группа sh-NC, # P < 0,05 vs. группа Oe-NC. Измерительные данные изображены как среднее ± стандартное отклонение, сравнения между двумя группами оценивали независимым t-тестом, сравнения среди множества групп — однофакторным ANOVA с последующим тестом Тьюки

Специфический связывающий регион между MALAT1 и miR-143 предсказывали онлайн-аналитическим ПО (рис. 4c). Результаты анализа двойной люциферазной репортерной системы показали, что люциферазная активность снижалась в группе MALAT1-WT + miR-143 mimic по сравнению с группой MALAT1-WT + mimic-NC (P < 0,05). Однако не было значимой разницы в люциферазной активности в группе MALAT1-MUT + miR-143 mimic относительно группы MALAT1-MUT + mimic-NC (P > 0,05), что указывает на то, что miR-143 специфически связывалась с MALAT1 (рис. 4d). Результаты RNA-pull down анализа сообщили, что уровень обогащения MALAT1 в группе Bio-miR-143-WT был повышен по сравнению с группой Bio-miR-NC (P < 0,05), но не было значимой разницы в уровне обогащения MALAT1 в группе Bio-miR-143-MUT (P > 0,05) (рис. 4e).

Биоинформатическое ПО предсказало целевые отношения между miR-143 и VEGFA (рис. 4f). Результаты люциферазной активности показали, что относительная люциферазная активность подавлялась после ко-трансфекции VEGFA-WT и miR-143 mimic в эндотелиальные клетки (P < 0,05). Однако относительная люциферазная активность эндотелиальных клеток не изменялась при ко-трансфекции VEGFA-MUT и miR-143-mimic (P > 0,05) (рис. 4g). Было показано, что VEGFA является прямой целевой геном miR-143.

Обсуждение

ИЧА — серьезное внутричерепное заболевание, которое в основном приводит к субарахноидальному кровотечению [18]. Предыдущее исследование продемонстрировало вовлеченность сетей конкурирующих эндогенных РНК, связанных с lncRNA, в ИЧА [19]. Также недавнее исследование предоставило доказательство того, что функциональный полиморфизм в промоторной области гена miR-143/145 связан с риском ИЧА [20]. В исследовании, проведенном Xu и соавт., показано, что сверхэкспрессия ангиогенических факторов, таких как VEGFA, может быть связана с формированием и разрывом ИЧА [21]. Для объяснения молекулярного механизма MALAT1 при ИЧА провели серию анализов, и результаты раскрыли, что ИЧА, индуцированная повреждением сосудистого эндотелия, регулируется сигнальной осью MALAT1/miR-143/VEGFA.

Во-первых, наше исследование предоставило весомые доказательства того, что MALAT1 и VEGFA упрегулированы, а miR-143 порегулирован в тканях ИЧА. Недавнее исследование представило, что MALAT1 является одной из наиболее упрегулированных lncRNA в процессе церебральной ишемии [22]. Другое исследование представило, что MALAT1 упрегулирована в клетках яичкового рака и намерена участвовать в процессах апоптоза, миграции и пролиферации клеток яичкового рака [23]. Исследование, касающееся профиля экспрессии неразорванных и разорванных ИЧА, продемонстрировало, что экспрессия ангиогенических факторов, таких как VEGFA, упрегулирована в разорванных аневризмах [21]. Более того, клиническое исследование представило, что кластер miR-143/145 у пациентов с ИЧА порегулирован по сравнению со здоровыми субъектами [11]. Кроме того, ранее обсуждалось, что miR-143/145 участвует в различных биологических процессах, ассоциированных с формированием аневризмы, и порегулирована у пациентов с ИЧА [20]. Все эти выводы более или менее отражают предыдущие результаты исследований.

Помимо вышеуказанных выводов, данное исследование также изучило функциональную роль MALAT1 при ИЧА через assays gain-of-function и loss-of-function. Можно резюмировать, что порегуляция MALAT1 снижала артериальное давление, сывороточные уровни ET-1, и экспрессию vWF и MMP-9 в тканях ИЧА. Ранее предполагалось, что порегуляция MALAT1 сдерживает упрегуляцию транскрипционного продукта ET-1, индуцированного глюкозой [24]. Также сообщалось, что эктопическая экспрессия MALAT1 является индуктором генерации vWF [25]. Другое исследование верифицировало, что деплеция MALAT1 в макрофагах, полученных из костного мозга, ингибирует экспрессию MMP-9 [26].

Также проводили клеточные эксперименты для дальнейшего подтверждения функций MALAT1 при ИЧА. Результаты указали, что глушение MALAT1 способствовало жизнеспособности сосудистых эндотелиальных клеток и подавляло апоптоз при ИЧА. Аналогично, документировано, что нарушение MALAT1 улучшает аортальную муральную архитектуру и замедляет рост аневризмы [8]. Дополнительно к нашим выводам, существует исследование, подчеркивающее, что низкая экспрессия MALAT1 индуцирует апоптоз и сдерживает пролиферацию клеток острой миелоидной лейкемии [27]. Другое исследование также продемонстрировало ингибирующие эффекты глушения MALAT1 на пролиферацию человеческих хрящевых клеток при остеоартрите [28]. Кроме того, предыдущее исследование в целом подтверждает, что порегуляция MALAT1 может индуцировать апоптоз и аттенюировать пролиферацию клеток глиомы [29]. Более того, низкая экспрессия MALAT1, индуцированная РНК-интерференцией, способствует апоптозу и подавляет пролиферацию клеток множественного миелома [30]. Коллективно эти исследования объяснили молекулярный механизм MALAT1 при ИЧА до некоторой степени.

Кроме того, данное исследование доказало, что miR-143 связывается с MALAT1, а VEGFA является целевым геном miR-143. Аналогично, статья утверждает, что MALAT1 напрямую связывается с miR-143 и подавляет его экспрессию [10]. Zhu и соавт. обнаружили, что MALAT1 реализует свои роли через взаимодействие с miR-143 в клетках шейночного рака [31]. Дополнительно подтверждено, что MALAT1 косвенно модулирует VEGFA через miR-200b-3p [32]. Более того, другое исследование предполагало, что miR-143-3p медиатирует эффект ZFPM2 на ряд белковых мишеней в крови, включая VEGFA [33]. Тем не менее, взаимодействия между MALAT1, miR-143 и VEGFA при ИЧА не обсуждались и требуют дальнейшего изучения.

Заключение

Из этих результатов ясно, что глушение MALAT1 подавляет апоптоз и способствует жизнеспособности сосудистых эндотелиальных клеток при ИЧА за счет модуляции оси miR-143/VEGFA. Сеть коэкспрессии указывает на связь между MALAT1 и miR-143 с вовлечением VEGFA. Выводы данного исследования частично раскрывают патогенез инициации и прогрессирования ИЧА, и изученные мишени могут стать заметной потенциальной точкой входа для раскрытия патологии ИЧА с другой перспективы. Ограниченно, дальнейшие крупномасштабные исследования необходимы для всестороннего иллюстрирования механизмов оси MALAT1/miR-143/VEGFA при ИЧА.

Доступность данных и материалов

Авторы не имеют данных для обмена, так как все данные уже показаны в представленной рукописи.

Аббревиатуры

TMDs:

Переходные металл дильхогениды

2D:

Двумерные

MR:

Магнитосопротивление

BLG:

Двуслойный графен

SL-MoSe₂ :

Монослойный MoSe₂

CNP:

Точка зарядной нейтральности

AFM:

Атомно-силовая микроскопия