Биосовместимость градуированных наностеклянных/циркониевых стоматологических материалов после старения

Аннотация

Система градуированного наностекла/циркония (G/Z) была создана путем инфильтрации наностекла в поверхность наноциркония, что усилило прочность сцепления ядро-фанер. Старение является критическим фактором для иттрий-стабилизированного тетрагонального циркония поликристаллов (Y-TZP), поэтому необходимо оценить, как старение влияет на биосовместимость систем G/Z перед клиническим применением. Человечные гингивальные фибробласты (HGF) посевали на нестарившиеся и старевшие образцы G/Z и Y-TZP на 2–72 ч. Проводились тесты: раздражение слизистой полости рта, живучесть клеток, адгезия и окислительный стресс. Метаболическая активность значимо снизилась в старевших G/Z и Y-TZP к 72 ч (P < 0,00001). Значимых различий в живучести между G/Z и Y-TZP во всех временных точках, до и после старения, не обнаружено. Выработка РАК увеличилась к 72 ч для старевших G/Z и Y-TZP, но различия незначимы (P > 0,05). Скорость адгезии росла после старения для обоих материалов, однако G/Z и Y-TZP показывали сравнимую адгезию (P > 0,05). Макроскопические и микроскопические оценки раздражения для старевших и нестаревших G/Z были 0, указывая на отсутствие раздражения.

Выводы

Система G/Z демонстрирует отличную биосовместимость и перспективна для будущих клинических применений.

Введение

Стоматологические керамики из циркония, в частности 3 моль% иттрий-стабилизированный тетрагональный цирконий поликристалл (3Y-TZP), ценятся за высокую прочность и сопротивление трещинообразованию благодаря механизмам трансформационного упрочнения, что делает их распространенными в протезировании [1]. Однако фанерный фарфор, наносимый на циркониевые ядра, часто разрушается в виде сколов или делиминации, преимущественно из-за несовпадения коэффициентов термического расширения и модулей упругости между ядром и фанерой [2–4]. Для решения этой проблемы мы ранее предложили систему градуированного наностекла/циркония (G/Z), инфильтрирующую низкомодульное наностекло в поверхность спеканного наноциркония, достигнув прочности сцепления в три раза выше обычных систем [4].

Старение Y-TZP — вызванное влажностью, механической нагрузкой и низкой температурой — вызывает шероховатость поверхности, микротрещины и тетрагонально-моноклинную (t-m) фазовую трансформацию, что может ухудшить механические свойства [5–9]. Поскольку химия поверхности и шероховатость влияют на биосовместимость, критически важно оценить, как старение влияет на взаимодействие системы G/Z с биологическими тканями.

Предыдущие работы Zhang et al. демонстрировали механические преимущества стекла-инфильтрированного циркониевого композита [10, 11], однако биосовместимость этого градуированного композита, особенно после старения, оставалась неизвестной. Данное исследование заполняет этот пробел, сравнивая G/Z с клинически принятым Y-TZP, оценивая живучесть клеток, морфологию, адгезию, окислительный стресс и раздражение слизистой до и после старения.

Методы

Подготовка образцов

Образцы Y-TZP, одобренные для клинического использования, служили контролем. Все образцы были единообразными пластинами (1,5 × 1,5 × 0,2 см) согласно стандартам ISO 13356 для прогибаемых стержней с полированными поверхностями.

Подготовка образцов G/Z

Стеклянные порошки измельчали до нанометрового размера в мельнице Emax. Состав инфильтрирующего стекла детален в Таблице 1 [4]. Порошки иттрий-циркония (5,18 масс.% Y₂O₃, марка TZ-3Y-E, Tosoh) унияксиально прессовали под 150 МПа в течение 2 мин, частично спекли при 1350 °C в течение 2 ч и шарошлифовали до 200 ячеек. Подложочные образцы предупрели при 1200 °C в течение 2 ч для формирования пористой сети. Расплавленные стеклянные суспензии наносили на верхнюю поверхность и инфильтрировали при 1350 °C в течение 2 ч, одновременно достигая инфильтрации и уплотнения.

Подготовка образцов Y-TZP

Заготовки Y-TZP фрезеровали и спекли до полной плотности с использованием CAD/CAM системы (Zenostar, Weiland Dental).

Клеточная культура

HGF культивировали в DMEM/F-12 с добавлением 10% фетового бычьего сывороточного, 1% пенициллин/стрептомицин, 1% L-глутамин и 1% незаменимых аминокислот при 37 °C, 5% CO₂. Среду меняли каждые 3 дня. Клетки отщепляли ПБС и трипсином-ЭДТА, затем посевали на каждый субстрат по 1 × 10⁵ клеток/мл для всех анализов.

Старение

Механическое старение моделировало условия жевания: образцы помещали в искусственную слюну при 37 °C, подвергали трехточечному изгибу нагрузке 80 Н при 2 Гц в течение 10⁵ циклов, следуя протоколам [12, 13].

Живучесть клеток

Живучесть оценивали в 2, 24, 48 и 72 ч с помощью анализа alamarBlue® (10% в DMEM). После инкубации добавляли 500 мкл красителя, инкубировали 4 ч и измеряли флуоресценцию (возбуждение 530 нм, эмиссия 580 нм) на спектрофотометре Synergy™ H4 (BioTek). Эксперименты проводили в трипликате в трех запусках. Живучесть (%) = (плотность обработанных колодцев) / (плотность контрольных колодцев).

Окислительный стресс

Уровень реактивных форм кислорода (РФК) количественно определяли хемилюминесценцией с использованием набора Reactive Oxygen Species Assay Kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).

Адгезия клеток

HGF культивировали 2 ч на поверхностях образцов до и после старения. После фиксации ядра окрашивали DAPI (Yeasen), изображения получали на инвертированном флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss LSM 510. Скорость адгезии считали как прикрепленные клетки / всего посеянных клеток по пяти случайным полям 450 × 450 мкм при увеличении ×200.

Морфология клеток

После 2 ч инкубации клетки на поверхностях G/Z фиксировали и окрашивали для F-актина родамином фаллоидина (1:100 в 3% БСА). Изображения получали на Zeiss LSM 510. Морфологию также изучали СЭМ (Philips XL-30 ESEM). Образцы монтировали на стеклянные коверклы и контрастно окрашивали DAPI.

Тест на раздражение слизистой полости рта

Десять самцов вистаровых мышей получали старевший G/Z в одну щечную сумку и нестаревший G/Z в противоположную, следуя стандартам YY/T 0127.13-2009. Через 2 недели сумки осматривали макроскопически, а слизистая щеки гистологически изучали после окраски ГЭ. Индексы раздражения вычисляли вычитанием контрольных оценок из тестовых.

Статистический анализ

Однофакторный дисперсионный анализ (SPSS 22.0) оценивал объединенные данные по живучести, окислительному стрессу и адгезии. Значимость устанавливали при P < 0,05.

Результаты

Структура градуированного слоя

Толщина градуированного слоя в среднем составляла 0,9–1,0 мм. Изображения СЭМ (рис. 1a, b) показывают поверхность, состоящую из остаточного стекла, стекло-покрытых циркониевых зерен и межзernовых пустот — особенностей, способствующих сильной адгезии ядро-фанер. Картирование ЭДС (рис. 1c) демонстрирует градиент: концентрация Zr растет вглубь материала, тогда как Si, Al и La уменьшаются, подтверждая намеренный композиционный градиент [4].

Физико-химические свойства G/Z. a Структурная диаграмма. b СЭМ изображение. c ЭДС анализ функционально градуированного слоя.

Живучесть клеток

Метаболическая активность значимо снизилась в старевших G/Z и Y-TZP к 72 ч (P < 0,00001) (рис. 2a). Значимого снижения не наблюдалось в 2, 24 или 48 ч для любого материала. Живучесть G/Z и Y-TZP не отличалась ни в одной временной точке, до или после старения (P > 0,05). Данные суммированы на рис. 2a.

Биосовместимость G/Z и Y-TZP до и после старения. Данные представлены как среднее ± СД, n = 5. a Живучесть HGF на старевших и нестаревших образцах. b Выработка РАК. c Скорость адгезии. Значимость относительно контрольной группы: #P < 0,01; *P < 0,05.

Окислительный стресс

Старевшие G/Z и Y-TZP показали значимый рост РАК к 72 ч (P < 0,00001). Значимых различий на более ранних этапах не было (P > 0,05). G/Z и Y-TZP производили сопоставимые уровни РАК на протяжении всего исследования, как до, так и после старения (P > 0,05).

Адгезия клеток

Скорость адгезии увеличилась для обоих G/Z и Y-TZP после старения (рис. 2c). Значимых различий между двумя материалами до или после старения не существовало (P > 0,05). Репрезентативные изображения адгезии клеток на Y-TZP и G/Z до и после старения показаны на рис. 3.

Адгезия клеток к G/Z и Y-TZP до и после старения. a Старевший G/Z. b Нестаревший G/Z. c Старевший Y-TZP. d Нестаревший Y-TZP.

Морфология клеток

Флуоресцентная визуализация показала, что клетки адгерируют к старевшим и нестаревшим G/Z, с усиленным расплющиванием и выпрямлением на старевших поверхностях (рис. 4a–c). СЭМ подтвердил хорошо расплющивающиеся полигональные клетки с обширными микровиллами на обеих поверхностях (рис. 5a, b).

Прикрепление, расплющивание и морфология HGF на G/Z до и после старения, флуоресцентная микроскопия. a, b Старевший G/Z. c Нестаревший G/Z. Клетки культивировали 72 ч на субстратах, затем фиксировали и окрашивали для филаментозного актина (F-актин, красный) и ядер (синий).

СЭМ микрографии морфологии HGF на G/Z до и после старения 72 ч после посева. a Старевший G/Z. b Нестаревший G/Z. Оригинальное увеличение: ×2000.

Тест на раздражение слизистой полости рта

И макроскопические, и микроскопические оценки раздражения для старевших и нестаревших G/Z были 0, указывая на отсутствие раздражения. Гистопатология подтвердила отсутствие изменений слизистой (рис. 6a, b).

Патологоанатомическое исследование слизистой, обработанной старевшим G/Z (a) и нестаревшим G/Z (b).

Обсуждение

Металлокерамические сплавы все чаще уступают место безметалловым альтернативам из-за опасений по поводу выделения ионов металлов [14–18]. В то время как многие исследования фокусируются на улучшении керамики, система G/Z предлагает перспективный путь повышения характеристик циркония без добавления металлических компонентов. Это исследование демонстрирует, что G/Z сохраняет биосовместимость, сравнимую с Y-TZP, даже после старения, имитирующего реалистичные условия полости рта.

Старение снизило пролиферацию клеток к 72 ч для обоих материалов, что согласуется с некоторыми данными литературы о снижении биосовместимости после старения [20] и противоречит другим, отмечающим улучшение [21]. Вариации, вероятно, обусловлены различиями в протоколах старения. Наш протокол — нагрузка 80 Н, 2 Гц, 10⁵ циклов в искусственной слюне при 37 °C — отражает клинические жевательные силы и температуру, обеспечивая реалистичную оценку эффектов старения [22].

Наблюдаемое снижение живучести и рост РАК могут отражать диффузию ионов и локальные напряжения от t-m трансформации, которые могут нарушить целостность клеток [6, 23].

Интересно, что старение увеличило адгезию для обоих G/Z и Y-TZP без изменения относительных скоростей адгезии. Огрубевшие, гидрофильные поверхности после старения, вероятно, усиливают адсорбцию белков, способствуя лучшему прикреплению клеток [27–29]. Сопоставимая адгезия указывает на то, что поверхностные свойства G/Z остаются благоприятными после старения.

In vivo тест на раздражение не выявил гистопатоологических изменений, подтверждая безопасность G/Z для контакта со слизистой. Небольшое количество моноклинной фазы, вводимое при инфильтрации, вероятно, сохраняет механическую целостность, сохраняя биосовместимость, как показано в предыдущих работах по Al₂O₃-инфильтрированному Y-TZP [30].

Другие стекло-циркониевые композиты демонстрировали хорошую биосовместимость и биоактивность in vitro и in vivo [31–33]. Наши результаты расширяют эти данные на систему градуированного наностекла/циркония, предлагая материал, балансирующий механическую прочность, эстетику и биологическую безопасность.

Выводы

Оценка биосовместимости — включая живучесть клеток, адгезию, морфологию, окислительный стресс и слизистое раздражение — показывает, что G/Z работает на уровне Y-TZP до и после старения. Эти результаты позиционируют G/Z как перспективного кандидата для стоматологических протезов. Дальнейшие всесторонние in vitro и in vivo исследования необходимы для подтверждения этих предварительных выводов.

Аббревиатуры

DAPI:

4′,6-Диамидино-2-фенилиндиол дигидрохлорид

F-актин:

Филаментозный актин

FGM:

HAp-Al₂O₃-ZrO₂

G/Z:

Градуированное наностекло/цирконий

SEM:

Растровое электронное микроскопирование

t-m:

Тетрагональный в моноклинный

Y-TZP:

Иттрий-стабилизированный тетрагональный цирконий поликристалл