Разработка электропряденого биокомпозита хитозан-полиэтиленоксид / фибриноген для потенциального заживления ран

Фон

Несмотря на многочисленные успехи, достигнутые в области лечения ран, в продажу поступило мало биоактивных повязок, способных улучшить процесс заживления. Этот недостаток успешного продукта можно объяснить сложностью процесса заживления ран, в котором задействованы многочисленные растворимые медиаторы, клетки крови, паренхиматозные клетки и компоненты внеклеточного матрикса (ЕСМ). Факторы роста играют центральную роль в процессе заживления ран, способствуя пролиферации, миграции и дифференцировке клеток. Однако быстрое выведение и короткие периоды полураспада в организме [1,2,3] ограничивают клиническое применение терапии факторами роста для ускорения заживления и регенерации тканей [4, 5]. В настоящее время повторное введение факторов роста in vivo необходимо для достижения терапевтических эффектов (например, рекрутирования и дифференцировки клеток). Разработка раневой повязки, которая способна устойчиво и локализовать доставку фактора роста, значительно улучшила бы результаты лечения и ускорила бы клиническое внедрение.

Фактор роста тромбоцитов (PDGF) играет важную роль в качестве инициатора и посредника заживления ран; он действует как хемотаксический агент для нейтрофилов, моноцитов и фибробластов [6] и помогает регулировать отложение матрикса. Кроме того, PDGF может ингибировать дифференцировку фибробластов в миофибробласты, что может влиять на сокращение раны и уменьшать образование рубцов [6]. PDGF, продаваемый под торговой маркой Regranex®, является единственным фактором роста, одобренным в настоящее время FDA, и предназначен для лечения диабетических язв нижних конечностей. Ежедневное местное применение геля Regranex® (2,2 мкг / см ² язвы) на 30% ускоряет заживление с минимальными побочными эффектами. Однако ежедневное местное применение и удаление Regranex® неудобно и может отрицательно сказаться на качестве жизни пациента.

Электропрядение было признано известным методом изготовления биомиметических нановолоконных каркасов с использованием биологически значимых полимеров. Многочисленные биоразлагаемые синтетические (например, поликапролактон) и натуральные полимеры (например, коллаген) были электроспрядены в нетканые нановолоконные каркасы, которые демонстрируют высокое отношение площади поверхности к объему и характеристики пористости, которые важны для доставки лекарств и перевязки ран. Встречающиеся в природе полимеры (например, коллаген, эластин и фибриноген) являются особенно привлекательными материалами для перевязки ран из-за их биоактивности, биосовместимости и уникальной способности связывать специфические факторы роста, такие как PDGF. Фибриноген (Fb), глобулярный белок плазмы с массой 340 кДа, играет важную роль в образовании сгустка через его активированную форму, фибрин, который функционирует как временная матрица для восстановления и регенерации тканей. Отсутствие Fb и фибрина коррелировали с дефектами заживления ран [7]. Продукты на основе Fb демонстрируют биоразлагаемость, неиммуногенность и стимулируют клеточную миграцию и ранее были разработаны как гидрогели [8,9,10] и кабели для влажной экструзии [11, 12]; однако физические и структурные свойства этих материалов ограничивают их клиническое применение. Гидрогелям не хватает структурной и механической целостности для длительного использования, а волокна, полученные при влажной экструзии, имеют экспоненциально больший диаметр (200–250 мкм), чем нативный ECM (200–500 нм). Wnek et al. продемонстрировали, что электроспиннинг, однако, дает возможность создавать каркасы из Fb, которые очень напоминают естественные структуры ECM [13]. Хотя полученные нановолокна демонстрируют улучшенные механические свойства по сравнению с гидрогелями, структура все еще не обладает оптимальными механическими свойствами для перевязки ран [14].

Для улучшения механических свойств фибриногенового каркаса электроспрядения можно ввести дополнительный полимер для упрочнения нановолокон [15]. В частности, хитозан (CS), N -деацетилированное производное хитина, как было показано, обладает желаемыми антимикробными свойствами при наложении перевязочного материала для ран [16, 17]. Помимо того, что CS является мощным противомикробным препаратом, он был электроспряден для различных биомедицинских применений, включая управляемую регенерацию кости [18, 19], трансдермальную доставку лекарств [20], направленную дифференцировку стволовых клеток [21] и гемостатирование [22]. Из-за поликатионной природы хитозана возникают значительные трудности при электроспиннинге с использованием обычных растворителей. Чтобы преодолеть эти трудности и улучшить электропрядильность, CS смешивали с различными другими полимерами, такими как поли (винилпирролидон) [23], поли (этиленоксид) (PEO) [16] и поли (виниловый спирт) [24]. Точно так же поликатионная природа CS ограничивает успешное сочетание с Fb в единый каркас из-за сильных электростатических взаимодействий. В данной работе это ограничение было преодолено за счет использования универсальной системы электропрядения с двумя соплами. Полученные нановолоконные каркасы анализировали с использованием различных физико-химических характеристик. Мы предположили, что новый комбинаторный нановолоконный каркас CS-Fb представляет собой жизнеспособного кандидата на биоактивную и биомиметическую раневую повязку, которая может доставлять PDGF и может эффективно влиять на миграцию фибробластов, необходимую для заживления ран.

Методы

Материалы

Уксусная кислота (ледяная, ≥ 99,85%), CS (низкомолекулярная, деацетилирование 75–85%), PEO (молекулярная масса 300 000 г / моль), Fb (тип IS, 65–85% белка), 1,1,1, 3,3,3-гексафторизопропанол (HFIP) и бычий сывороточный альбумин (BSA, ≥ 96%) были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Диметилсульфоксид (ДМСО) был приобретен в EMD Millipore (Биллерика, Массачусетс, США). Кожные фибробласты человека (PCS-201-012) и реагенты для клеточных культур были приобретены в Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США). Не содержащий носителя рекомбинантный фактор роста человеческого тромбоцита-BB (rhPDGF-BB) был приобретен у PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA). Все реагенты были реактивными и использовались без дополнительной очистки или модификации.

Приготовление композитных каркасов электропряденого сплава хитозан-полиэтиленоксид / фибриноген

Исходные растворы хитозан-PEO получали растворением CS и PEO в 1% уксусной кислоте с BSA (0,5% v / v ) и ДМСО (10% об. / v ) для получения общего содержания полимера 5,5 мас.% при массовом соотношении CS к ПЭО 2:1. Полиэтиленоксид был добавлен для улучшения способности электроспина CS, как описано ранее [16]. Исходные растворы фибриногена (110 мг / мл) получали растворением Fb в одной части 10 × минимально необходимой среды Игла (EMEM) и девяти частях HFIP. Исходные растворы CS-PEO и Fb перемешивали при комнатной температуре до полного растворения. Для нагруженных каркасов PDGF смешивали с каждым полимерным раствором непосредственно перед электроспиннингом. Композитные нановолоконные каркасы Electrospun CS-PEO / Fb были изготовлены с использованием системы электропрядения с несколькими соплами (рис. 1). Растворы загружали индивидуально и механически закачивали в систему с помощью одноразового шприца, подключенного к фильере 18-го размера и шприцевому насосу NE-1000 (New Era Pump Systems, Фармингдейл, Нью-Йорк), при скорости потока 0,7 и 1,0 мл ч ^-1 для CS-PEO и Fb соответственно. Коллектор оправки, вращающийся со скоростью 25 об / мин, был расположен между вершинами фильеры на расстоянии 22 см для CS-PEO и 12,5 см для Fb. В процессе изготовления на наконечники фильеры для растворов полимеров CS-PEO и Fb подавалось постоянное напряжение 28 и 22 кВ соответственно. Изготовленные каркасы из нановолокон либо собирали на 18-сантиметровые покровные стекла для биологических анализов, либо вырезали непосредственно из оправки для анализа проницаемости и прочности на разрыв. Все эксперименты по электроспиннингу проводили при комнатной температуре и относительной влажности 35–45% в течение 3 ч. Образцы, содержащие PDGF, хранили при -20 ° C в эксикаторе, а незагруженные каркасы после изготовления хранили в эксикаторе при комнатной температуре.

Схема электропрядильного устройства с двумя фильерами

Морфология и диаметр нановолокна

Нановолоконные каркасы, полученные методом электроспряжения, покрывали напылением золотом и наблюдали с помощью автоэмиссионной сканирующей электронной микроскопии (FESEM) (Zeiss Sigma VP-40, Германия). Было сделано двадцать микрофотографий каждого каркаса, и три индивидуально спряденных каркаса были проанализированы для каждого состава. Средние диаметры нановолокон рассчитывали путем измерения пяти случайных точек на микрофотографии с помощью ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Всего было проведено 100 измерений для каждого состава каркаса.

Характеристика химического состава поверхности

Времяпролетная ионная масс-спектрометрия (ToF-SIMS) использовалась для анализа химии поверхности и вкладов полимерных компонентов в каркас. ToF-SIMS - это чувствительный и углубленный метод анализа поверхности, который оценивает химический состав верхнего нанометрового слоя материала путем бомбардировки высокоэнергетическим Bi ₃ ²⁺ кластеры в сверхвысоком вакууме [25, 26]. Фрагменты вторичных ионов, выброшенные с поверхности материала, затем анализируются на основе отношения их атомной массы к заряду (m / z) и используются для определения общего химического состава поверхности.

ToF-SIMS-анализ был выполнен Evans Analytics Group (EAG, Саннивейл, Калифорния) с использованием ToF-SIMS IV (Ion-ToF GmBH, Германия) с висмутовой ионно-ионной пушкой (30 кВ). Прибор работал в режиме ионного микрозонда, при котором для каждого образца были получены три спектра положительных и отрицательных ионов. Выбранные положительные и отрицательные ионы были нанесены на карту растровой области 50 × 50 мкм с разрешением изображения 2048 × 2048 пикселей, чтобы обеспечить картирование полимерных компонентов каркасов. Нормализованная интенсивность, определяемая как количество каждого вторичного иона, деленное на общее количество зарегистрированных ионов, умноженное на 10000, сообщалось для каждого фрагмента. Было проанализировано среднее значение трех разных мест на поверхности шести независимо изготовленных образцов ( n =6). Распределение полимеров CS-PEO и Fb, проанализированное с помощью ToF-SIM, было репрезентативным для всего каркаса.

Углы контакта с водой каркасов CS-PEO, CS-PEO / Fb и Fb определяли в соответствии с Американскими стандартами для методов тестирования (ASTM) D7334-08. Нанофиброзные каркасы наносили электропрядением на покровные стекла. Одну каплю дистиллированной воды (2 мкл) наносили на поверхность каркаса и измеряли угол смачивания в течение 30 с с помощью анализатора формы капли Krüss DSA10 MK2 (Krüss, Гамбург, Германия). Измерения повторяли три раза в разных местах для каждого образца и рассчитывали средний угол смачивания. Были проанализированы шесть независимо электроспряденных каркасов ( n =6).

Механическая прочность на одноосное растяжение

Механические свойства матриксов из электропряденого волокна измеряли при комнатной температуре с использованием Instron® E3000 ElectroPuls (Instron, Canton, MA), оборудованного датчиком нагрузки 250 Н, при скорости деформации 1 мм мин ^-1 . Толщину образцов измеряли в шести случайных положениях с помощью трехмерного лазерного сканирующего микроскопа Keyence VK-200 (Keyence, Итаска, Иллинойс). Толщина каркасов, используемых для испытаний на растяжение, составляла 93,8 ± 7,4 мкм. Перед испытанием каркасы разрезали на прямоугольные образцы размером 40 × 25 мм. Полученные данные были представлены и нанесены на график в виде кривых "напряжение-деформация", где растягивающее напряжение определялось как отношение силы к площади поперечного сечения образца, а деформация определялась как изменение длины по сравнению с исходной длиной. Расчеты модулей Юнга, растягивающего напряжения и деформации при разрыве были получены из кривых «напряжение-деформация» в среднем для десяти образцов на рецептуру.

Скорость переноса водяного пара

Скорость переноса водяного пара каркасов CS-PEO / Fb измеряли согласно методу осушителя ASTM E96 / E96M. В общей сложности шесть независимо друг от друга электропряденых образцов были приготовлены для каждого состава и помещены в отверстие сосудов для испытаний, содержащих многоразовый силикагелевый осушитель, при комнатной температуре и относительной средней влажности 58,2 ± 5,2%. Скорость пропускания водяного пара (СПВП) рассчитывалась по весу тестовых контейнеров, измеренному в разные моменты времени в течение 48 часов:

где G представляет изменение веса испытательного контейнера, t истекшее время, а A площадь поперечного сечения каркаса.

Жизнеспособность клеток in vitro

Непрямая цитотоксичность каркасов оценивалась на основе подхода, адаптированного из стандартного метода тестирования ISO10993-5 [27, 28]. Кожные фибробласты человека культивировали при 37 ° C и 5% CO ₂ . в бессывороточной среде фибробластов и обновлять каждые 3 дня. Как только клетки достигли слияния, их обрабатывали трипсином и высевали в 12-луночные планшеты (10000 клеток / мл). На следующий день добавляли среду и вводили каркасы из нановолокна. За пролиферацией клеток наблюдали в течение 120 часов с помощью анализа пролиферации клеток 2- (4-йодофенил) -3- (4-нитрофенил) -5- (2,4-дисульфофенил) -2H-тетразолия натрия (WST-1).

Визуализация фибробластов

Дермальные фибробласты человека обрабатывали трипсином и высевали на каркасы CS-PEO, Fb и CS-PEO / Fb. Через 24 часа инкубации при 37 ° C и 5% CO ₂ клетки промывали и окрашивали набором для определения жизнеспособности клеток LIVE / DEAD ™ (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в соответствии со спецификациями производителя. Кроме того, адгезию и прикрепление человеческих фибробластов к каркасу оценивали путем окрашивания Phalloidin-Atto 565 (Sigma Aldrich и 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI; ThermoFisher Scientific) в соответствии со спецификациями производителя. снято с помощью инвертированного конфокального микроскопа (Nikon C1, C1EZ, Мелвилл, Нью-Йорк, США).

Деградация in vitro

Деградацию нановолоконных каркасов CS-PEO / Fb проводили в основной среде фибробластов (FBM, ATCC) при 37 ° C и 5% CO ₂ . Матрицы погружали в FBM и инкубировали в течение 1, 6, 24 или 48 часов. Регистрировали исходный сухой вес каждого каркаса; в каждый момент времени каркасы промывали, сушили вымораживанием и снова взвешивали. Деградация каркаса рассчитывалась по следующей формуле:

где W ₀ - начальный вес каркаса, а W _t - вес строительных лесов в соответствующий момент времени.

Выпуск и обнаружение PDGF

Элюаты, собранные в определенные моменты времени во время эксперимента по деградации in vitro, анализировали с использованием набора для ELISA, специфичного для rhPDGF-BB (R&D System, Миннеаполис, Миннесота). Обнаруженные значения абсорбции сравнивали со стандартом, как указано в инструкциях производителя для определения концентрации PDGF. Количество обнаруженного PDGF было нормализовано к массе (мг) соответствующего использованного каркаса.

Свойство миграции фактора роста, производного от тромбоцитов

Миграцию дермальных фибробластов человека оценивали с использованием набора для анализа миграции клеток ORIS ™ (Platypus Technologies, Мэдисон, Висконсин) для оценки биоактивности PDGF. Вкратце, фибробласты, обработанные митомицином C (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), обрабатывали трипсином и высевали в 96-луночные планшеты, содержащие пробки, предоставленные производителем, и инкубировали при 37 °. C и 5% CO ₂ с ночевкой. На следующий день пробки удаляли, создавая зоны миграции, в которые добавляли 100 мкл элюатов, собранных в различные моменты времени, и инкубировали в течение дополнительных 24 часов. Свежеприготовленные 50 нг / мл ^-1 PDGF и среды базальных фибробластов использовали в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно. Миграцию фибробластов выражали как кратное изменение по сравнению с миграцией, вызванной 50 нг / мл ^-1 Лечение PDGF. Исследования были выполнены в трех повторностях в трех независимых экспериментах для трех нагрузочных концентраций (2, 4 и 8 мкг / мл).

Статистический анализ

Непрерывные данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение. Различия между средними значениями групп анализировали с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Тест множественного сравнения Тьюки использовался, чтобы определить, какие средние значения из группы средних статистически различаются. Статистическая значимость была установлена ​​на уровне α . =0,05. Все данные были проанализированы с помощью GraphPad Prism (Сан-Диего, Калифорния, США).

Результаты и обсуждение

Было показано, что сочетание различных полимеров значительно улучшает свойства получаемого композита [29, 30]. Комбинированные полимерные системы эффективно позволяют модулировать прочность, гибкость, биодеградацию и кинетику высвобождения лекарственного средства каркаса, которые являются важными параметрами для перевязки ран. Однако создание уникальных композитов может быть ограничено внутренними химическими взаимодействиями между составляющими полимерами. Например, наблюдали образование полимерного осадка при смешивании отрицательно заряженного Fb и положительно заряженного CS; это наблюдение хорошо задокументировано для молекул с сильными электростатическими взаимодействиями в различных условиях растворителя [31,32,33]. Следовательно, изготовление каркаса из полимерного композита CS-Fb потребовало использования метода электроспиннинга с двойной экструзией, как описано ранее [34].

Морфология нановолокон CS-PEO / Fb

Средние диаметры волокон для каркасов CS-PEO, CS-PEO / Fb и Fb составляли 269,9 ± 68,4, 202,3 ± 113,2 и 351,1 ± 101,7 нм соответственно (рис. 2). Интересно, что композитные каркасы CS-PEO / Fb демонстрируют более тонкие нановолокна, чем каркасы CS-PEO или Fb. Уменьшение диаметра волокна может быть связано с дополнительными электростатическими силами, создаваемыми одновременно заряженными полимерными струями [35,36,37]. Таким образом, отталкивание полимерных струй друг от друга, вызванное этими силами, может увеличить как расстояние между фильерами, так и время осаждения. В результате увеличенное время осаждения коррелирует с повышенной нестабильностью изгиба, которая, как известно, вызывает удлинение волокна и образование более тонких волокон.

Репрезентативные микрофотографии FESEM каркасов из электроспрядника. а CS-PEO, средний диаметр 269,9 ± 68,4 нм. б CS-PEO / Fb, средний диаметр 202,3 ± 113,2 нм. c Fb, средний диаметр 351,1 ± 101,7 нм ( n =100)

Характеристика химического состава поверхности с помощью ToF-SIMS и угла смачивания воды

Спектры ToF-SIMS от каркасов CS, Fb и PEO показаны на рис. 3. Обычно для различения отдельных полимерных компонентов можно использовать уникальные химические отпечатки пальцев. Однако из-за химического сходства между CS и Fb существует ряд азотсодержащих веществ (C ₃ H ₆ НЕТ ⁺ , Канал ₄ N ⁺ , CN ^- , и CNO ^- ) присутствуют в обоих спектрах, что затрудняет различение полимеров друг от друга. Однако, когда Fb был включен в каркас, общее количество CN ^- и CNO ^- виды увеличились, тогда как другие фрагменты остались неизменными или уменьшились. Поэтому, изучая изменения в CN ^- и CNO ^- интенсивности фрагментов позволили косвенно детектировать Fb. Точно так же увеличение C ₂ H ₅ О ⁺ (45 m / z) ионы были использованы для идентификации фрагментов этиленоксида ПЭО в композитных каркасах.

Представитель а положительный и б ToF-SIMS-спектры отрицательных ионов для чистого CS (вверху), Fb (в центре) и PEO (внизу). Обведенные фрагменты ионов использовались в качестве уникального отпечатка пальца для идентификации соединения

Чтобы выяснить наличие и распределение компонентов Fb в композитных каркасах, CNO ^- и CN ^- ионы были картированы на растре размером 50 × 50 мкм исходных и композитных каркасов для получения тепловых карт (рис. 4a, b). Тот же метод сопоставления был выполнен на C ₂ H ₅ О ⁺ для определения распределения ПЭО (рис. 4в). Повышенная интенсивность тепловой карты коррелировала с более высоким содержанием полимера Fb или PEO. Мы заметили, что интенсивности CNO ^- , CN ^- , и C ₂ H ₅ О ⁺ были равномерно распределены по растровой области 50 × 50 мкм композитных каркасов. Ожидается, что из-за толщины каркасов (93,8 ± 7,4 мкм) и послойного нанесения волокон состав поверхности будет репрезентативным для всего каркаса. Следовательно, данные ToF-SIM предполагают, что при изготовлении нановолоконных каркасов CS-PEO / Fb с использованием электропрядения с двумя фильерами отдельные компоненты равномерно осаждаются по всей композитной основе.

Сопоставление ToF-SIMS a CNO ^- , b CN ^- , и c С ₂ H ₅ О ⁺ ионные фрагменты на различных каркасах на площади растра 50 × 50 мкм

Углы смачивания с водой электропряденых волокнистых каркасов CS-PEO, CS-PEO / Fb и Fb составили 44,2 ° ± 5,1 °, 61,4 ° ± 7,6 ° и 115,7 ° ± 16,2 ° соответственно (рис. 5). Исходя из углов смачивания воды, каркасы CS-PEO и CS-PEO / Fb были гидрофильными (> 90 °), тогда как каркасы Fb были гидрофобными (<90 °). Краевые углы смачивания водой композитных каркасов CS-PEO / Fb продемонстрировали характеристики поверхности, которые находились между характеристиками их компонентов, что позволяет предположить, что CS-PEO и Fb были гомогенно осаждены во время изготовления. Поверхностные характеристики полимерных поверхностей играют важную роль в отложении белков и факторов адгезии. В частности, известно, что важные факторы бактериальной адгезии легче возникают на гидрофобных поверхностях, что способствует бактериальной колонизации [38]. Таким образом, гидрофильная природа CS-PEO / Fb может быть полезной для предотвращения прикрепления бактерий.

Поведение деионизированной воды на поверхности стеклянной подложки, каркасов CS-PEO, CS-PEO / Fb и Fb

Механическая прочность на одноосное растяжение строительных лесов из CS-PEO / Fb

Испытания на одноосное растяжение проводили на нановолоконных каркасах со средней толщиной 93,8 ± 7,4 мкм. Сводка результатов приведена в таблице 1, а соответствующие кривые напряжения-деформации показаны на рис. 6. Как правило, механические свойства композиционных материалов коррелируют с их наиболее слабыми составляющими. Результаты показывают, что каркасы, содержащие только Fb, не будут иметь идеальных механических свойств для перевязки ран. Это подчеркивает важность включения CS-PEO для получения более механически стабильного продукта.

Кривые напряжение-деформация каркасов CS-PEO, CS-PEO / Fb и Fb. Данные являются репрезентативными для десяти независимо изготовленных каркасов

Скорость переноса водяного пара в каркасах из CS-PEO / Fb

WVTR играет жизненно важную роль в поддержании идеальной влажности окружающей среды раны, что положительно влияет на грануляцию и эпителизацию клеток [39, 40]. Более высокие значения WVTR коррелируют с быстрым обезвоживанием раны из-за испарения и экссудации, что может отрицательно снизить температуру тела и увеличить метаболизм. И наоборот, чрезвычайно низкие значения WVTR коррелируют с накоплением экссудата, ингибированием заживления и повышенным риском инфекции. Ламке и др. сообщил, что WVTR для нормальной кожи составляет 204 ± 12 г м ⁻² день ⁻¹ и от 279 до 5138 г м ⁻² день ⁻¹ для поврежденной кожи в зависимости от состояния раны [41, 42]. Для эпителизации раны и улучшения заживления идеальный WVTR составляет 2028,3 ± 237,8 г м ⁻² день ⁻¹ сообщалось [43]. WVTR каркасов CS-PEO и Fb составляли 693,2 ± 95,7 и 686,1 ± 44,17 г м ^-2 день ⁻¹ , соответственно. Хотя каркасы из CS-PEO / Fb ближе к идеальному WVTR, чем оригинальные каркасы, (806,5 ± 56,1 г м ^-2 день ⁻¹ ) по-прежнему упал ниже идеального WVTR (рис. 7). Манипуляции с физическими параметрами каркаса могут улучшить WVTR, чтобы лучше имитировать заявленные идеальные скорости.

Скорость переноса водяного пара в каркасах из электропряденых CS-PEO, CS-PEO / Fb и Fb. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение ( n =6, * p <0,05 по сравнению с каркасами CS-PEO / Fb)

Жизнеспособность дермальных фибробластов человека in vitro

Каркасы хитозан-PEO / Fb не проявляли значительного пролиферативного действия на человеческие фибробласты в течение первых 48 часов (рис. 8); тем не менее, длительное воздействие через 72 часа приводило к статистически значимому снижению пролиферации по сравнению с контролем без каркаса. Результаты показывают, что каркас подавляет пролиферацию клеток, которая может накапливаться со временем.

Сравнение пролиферации дермальных фибробластов человека при воздействии Fb и CS-PEO / Fb электроспрядного каркаса ( n =9, * p <0,05 сравнения с «без контроля каркаса» в каждый момент времени)

Снижение пролиферативной способности может быть связано со степенью ацетилирования (DA), связанного с CS, который, как было показано, имеет сильные клеточные взаимодействия через свои положительные заряды [44]. Younes et al. продемонстрировали, что клетки карциномы мочевого пузыря, обработанные CS (> 50% DA), значительно снижали жизнеспособность через 24 часа, предполагая, что цитотоксичность CS напрямую связана с его DA, который может влиять на пролиферацию [45]. Этот эффект также может быть изолирован от экспериментальных условий in vitro; предыдущие исследования показали, что CS нетоксичен in vivo, поскольку продукты его биоразложения могут выводиться через метаболические пути [46]. Остаточный HFIP от процесса электроспиннинга также может способствовать наблюдаемой цитотоксичности. Однако такая же цитотоксичность не наблюдалась в каркасе из чистого Fb, полученного методом электропрядения, который также был приготовлен в HFIP. ГФИП, вероятно, был удален из электроспрядных каркасов в процессе изготовления из-за его высокой летучести. Наблюдаемое снижение жизнеспособности клеток было бы очевидным, если бы остаточный HFIP, включенный в систему волокон, высвобождался во время временного воздействия на фибробласты кожи человека.

Анализ LIVE / DEAD и клеточное прикрепление

На рис. 9a – c показано распределение и жизнеспособность дермальных фибробластов, высеянных на поверхность покрытого фибронектином стекла, ненагруженных каркасов CS-PEO / Fb и нагруженных PDGF (4 мкг / мл) каркасов CS-PEO / Fb. После 24 часов культивирования наблюдалось минимальное количество мертвых клеток по сравнению с живыми клетками. Никаких заметных различий между нагруженными PDGF и разгруженными каркасами замечено не было.

Конфокальные микрофотографии фибробластов, засеянных на a , d стекло, покрытое фибронектином; б , e выгруженные леса CS-PEO / Fb; и c , f PDGF-loaded (4 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. а – в Cells were stained with LIVE/DEAD™:live cells (green), dead cells (red). d–f Cells were stained with DAPI (blue) and phalloidin (red)

Fibrinogen serves as an important mediator of cellular attachment and growth during wound healing. Phalloidin stains cellular actin filaments allowing for visualization of fibroblast attachment. Figure 9c, d shows the actin filament morphology of the fibroblasts on the surface of fibronectin-coated glass, unloaded CS-PEO/Fb scaffolds, and PDGF-loaded CS-PEO/Fb scaffolds. Overall, normal fibroblast morphology was observed, with the exception of some rounder cells being present on the scaffold samples. The changes in morphology may be attributed to the presence of CS, as shown in previous studies [47]. Alternatively, the differences could be due to the small porosity of the scaffold and dimensionality of the fiber surface in comparison to the flat surface of the control.

In Vitro Degradation of Electrospun CS-PEO/Fb Scaffolds

Scaffold degradation was evaluated by obtaining the dry weight of the scaffold after incubation in FBM for up to 48 h (Fig. 10). The scaffolds degraded at a linear rate after an initial burst release of material within the first hour. Weight loss in the initial hour was likely due to the solubility of PEO in aqueous solutions [16], and the subsequent weight loss was likely due to Fb and CS release. This highlights a unique biphasic degradation profile that could be beneficial for the delivery of bioactive molecules. Concurrently, CS-PEO/Fb scaffolds were shown to maintain their substructure for a minimum of 48 h (Fig. 10:insert), and the addition of 8 μg/mL of PDGF did not alter the scaffold degradation properties.

Degradation of electrospun unloaded CS-PEO/Fb scaffolds and PDGF-loaded (8 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. Insert:FESEM micrograph of CS-PEO/Fb scaffold after 48 h of incubation (n  = 6)

In Vitro Release of PDGF

Cumulative releases of PDGF after 48 h of incubation were 1.8 ± 0.7, 4.4 ± 1.8, and 11.4 ± 4.8 ng of PDGF/mg of scaffold for initially incorporated concentrations of 2, 4, and 8 μg/mL of PDGF, respectively. The results demonstrated that PDGF was released from the scaffolds in a dose-dependent manner (Fig. 11).

PDGF is released from CS-PEO/Fb scaffolds for up to 48 h in a dose-dependent manner (n  = 10, *p  < 0.05 when compared to 2 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point, ^# p  < 0.05 when compared to 4 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point)

During the in vitro degradation, CS-PEO/Fb scaffolds exhibited a unique biphasic release profile, with 21.6 ± 0.1% of the total eluted PDGF being detected in the first hour followed by linear release kinetics. This observation was thought to be a result of the combined polymers and highlighted the functional importance of Fb as a reservoir for the sustained release of biologically critical molecules. Growth factors (e.g., PDGF/VEGF, FGF, and TGF-β families) have been shown to bind the Fb heparin domain with high affinity and have been reported to retain their bioactivity for over 7 days [48,49,50].

Effects of Released PDGF on Fibroblast Migration

Fold differences in fibroblast migration in response to the released PDGF eluates collected from the scaffolds at various time points are shown in Fig. 12. Previously published reports have demonstrated that fibroblast attachment and migration rates are affected by PDGF in a dose-dependent manner [51, 52]. For example, Gamal et al. showed when at least 50 ng/mL PDGF was delivered locally, adherent fibroblast migration was increased [52]. In addition, Thommen et al. reported that the distance of migration was significantly increased when exposed to PDGF concentrations greater than 10 ng/mL [53]. Therefore, the biological activity of the scaffold-eluted PDGF was measured by its ability to induce migration and was normalized to a single 50 ng/mL PDGF dose.

Human dermal fibroblast migration after 24 h exposure to scaffold eluates acquired at 1, 6, 24, and 48 h in FBM (n  = 8, *p  < 0.05 when compared to unloaded CS-PEO/Fb scaffold at each specific time point)

Eluates collected from electrospun scaffolds, which were loaded with 4 or 8 μg PDGF/mL polymer solutions, demonstrated similar levels of fibroblast migration when compared to a single 50 ng/mL treatment. The data suggest that PDGF delivered by electrospun nanofibers can be equally effective in promoting fibroblast migration as a single application of PDGF. Additionally, the migration elicited by the scaffold-released PDGF was sustained for 48 h. Sustained delivery of PDGF eliminates the need for daily applications, which is an advantage over commercially available treatments such as Regranex®.

Fibroblast migration reached a maximum when cells were treated with the 24-h eluates from each of the PGDF-loaded scaffolds. Notably, when fibroblasts were treated with the 6-h eluates from the 4 and 8 μg PDGF/mL electrospun scaffolds, the same level of maximum migration was achieved. This suggests that the rate of migration increased in response to increased PDGF loading. Additionally, 4 and 8 μg/mL PDGF-loaded scaffolds might be able to elicit fibroblast migration potentials beyond the detection limits of the current assay, which can only assess the endpoint of migration, but not the migration rate. Finally, results demonstrated that eluates from unloaded CS-PEO/Fb scaffolds were also capable of eliciting a linear increase in migration over the same elution time points, albeit less effectively than the PDGF-loaded scaffolds. This result is most likely mediated by the ability of fibrinogen to enhance fibroblast migration [54, 55]. In general, PDGF-loaded composite scaffolds significantly improved in vitro migration, compared to the individual components of the scaffold.

Conclusion

The versatility of electrospinning allows for the combination of advantageous properties of various polymers and proven bioactive molecules. We utilized this technique to fabricate unique CS-PEO/Fb scaffolds with the ability to release biologically active PDGF over 48 h. This study evaluated the chemical and physical properties of the nanofibrous scaffolds including (1) morphology, (2) physical and mechanical properties, (3) in vitro scaffold degradation, and (4) the ability to release functional PDGF in a dose- and time-dependent manner. Electrospun CS-PEO/Fb scaffolds demonstrated nanoscale morphological properties that are conducive to wound dressing applications, as well as an adequate WVTR, mechanical stability, and a unique biphasic PDGF delivery profile. Furthermore, PDGF maintained its biological function throughout the electrospinning process, and when combined with the natural, chemotactic properties of Fb elicited dermal fibroblast migration that is functionally equivalent to a single 50 ng/mL dose of PDGF. Overall, these results highlight the potential of CS-PEO/Fb scaffolds as a viable wound dressing capable of delivering bioactive PDGF to enhance fibroblast recruitment and wound healing.

Сокращения

CS:

Chitosan

DA:

Degree of acetylation

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

ECM:

Extracellular matrix

EMEM:

Eagle’s minimum essential media

Fb:

Fibrinogen

FBM:

Fibroblast blast media

FESEM:

Field emission scanning electron microscope

FGF:

Fibroblast growth factor

HFIP:

1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol

PDGF:

Platelet-derived growth factor

PEO:

Полиэтиленоксид

PLGA:

Poly(lactide-co-glycolide)

TGF-β:

Transforming growth factor beta

ToF-SIMS:

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry

VEGF:

Vascular endothelial growth factor

WVTR:

Water vapor transfer rate