Биосовместимость стоматологического материала наностекло-цирконий после старения

Фон

Стоматологическая керамика на основе диоксида циркония (например, стабилизированные иттрием тетрагональные поликристаллы диоксида циркония с 3 мол.% (3Y-TZP)) демонстрируют превосходную механическую прочность и превосходное сопротивление разрушению благодаря внутренним механизмам упрочнения трансформации, и они широко используются для изготовления протезов [ 1]. Материалы сердцевины из диоксида циркония обычно покрываются прозрачным облицовочным фарфором, чтобы скрыть их непрозрачный вид. Однако многослойные реставрации из диоксида циркония обычно не работают; сколы и расслоение облицовочной керамики считаются наиболее частой причиной неудач реставраций на основе диоксида циркония [2, 3]. Выкрашивание и расслоение облицовочной керамики было зарегистрировано в результате несоответствия коэффициента теплового расширения и модуля упругости сердцевины из диоксида циркония и облицовочной керамики [4]. Следовательно, в нашем предыдущем исследовании мы представили новую концепцию улучшения сцепления сердцевины и шпона путем пропитки низкомодульного наноразмерного стекла с соответствующим коэффициентом теплового расширения на поверхность диоксида циркония, спеченного из наночастиц диоксида циркония, таким образом, производя эластичное градиентное стекло. Системы наностекло / диоксид циркония (G / Z). Было продемонстрировано, что прочность сцепления систем G / Z с облицовочным фарфором в три раза выше, чем у традиционных систем на основе диоксида циркония [4].

Старение Y-TZP хорошо известно. Старение Y-TZP может быть вызвано окружающей средой в ротовой полости при воздействии влажности, механической нагрузки и низкой температуры, что приводит к шероховатости поверхности, микротрещинам и высвобождению частиц Y-TZP в организм [5, 6]. В присутствии влажности и низкой температуры может начаться фазовое превращение тетрагонального диоксида циркония в моноклинное (t-m). Объемное расширение кристалла приводит к локальному напряжению и микротрещинам на поверхности материала, позволяя воде проникать внутрь материала, что приводит к дополнительному фазовому превращению и ухудшению механических свойств [7,8,9]. Кроме того, сейчас широко известно, что физико-химические свойства биоматериала, такие как шероховатость поверхности и химический состав, влияют на его биосовместимость. Таким образом, необходимо оценить влияние деградации старения на биосовместимость G / Z.

Zhang et al. [10, 11] пропитали стекло в субструктуру из плотного диоксида циркония и разработали дифференцированный композит стекло-диоксид циркония с превосходными механическими свойствами. Однако биосовместимость дифференцированного композита стекло-цирконий неизвестна, особенно с учетом явления старения.

Следовательно, тестирование биосовместимости недавно разработанной системы G / Z имеет важное значение для ее клинического применения из-за добавления стеклянных материалов и последующих структурных изменений. Использование системы G / Z может решить проблему неудач реставраций на основе диоксида циркония и, таким образом, повысить их успешность. Таким образом, тестирование биосовместимости системы G / Z до и после старения предоставит рекомендации по биобезопасности для клинического применения G / Z.

В настоящем исследовании оценивалась биосовместимость системы G / Z до и после старения. Оценка включала тест на раздражение слизистой оболочки полости рта в сочетании с анализом жизнеспособности клеток, морфологии клеток, клеточной адгезии и реакции на окислительный стресс.

Методы

Подготовка образцов

Y-TZP - это биосовместимый материал, уже одобренный для клинического применения, и здесь образцы Y-TZP были созданы в качестве контрольной группы. Все образцы были изготовлены в виде однородных пластин (1,5 × 1,5 × 0,2 см). ISO 13356 описывает оценку испытанных образцов с упрощенной геометрией (изгибающиеся стержни) и полированной поверхностью.

Подготовка образцов G / Z

Стеклянные порошки измельчали ​​до получения наноразмерных частиц с помощью нанометрового шлифовального инструмента (Emax, Retsch, Haan, Северный Рейн-Вестфалия, Германия). Основные компоненты и процентное содержание (> 1 мас.%) Проникающего стекла приведены в таблице 1 [4]. Порошки диоксида циркония, стабилизированного иттрием (5,18 мас.% Y ₂ О ₃ , Марка ТЗ-3У-Э; Tosoh, Токио, префектура Токио, Япония) прессовали под одноосным давлением 150 МПа в течение 2 минут, а затем частично спекали при 1350 ° C в течение 2 часов в муфельной печи. Желаемые оксиды измельчали ​​в шаровой мельнице до порошков размером 200 меш. Образцы подложки Y-TZP предварительно подвергались предварительной сварке при 1200 ° C в течение 2 ч с образованием пористых структур. Суспензию расплавленного стекла наносили на верхнюю поверхность предварительно спеченных образцов пористой подложки Y-TZP. Затем образцы с покрытием пропитывали при 1350 ° C в течение 2 часов для получения градиентной структуры стекло-диоксид циркония. Инфильтрация и уплотнение стекла проводились одновременно.

Подготовка образцов Y-TZP

Заготовки Y-TZP (Weiland, Weiland Dental, Пфорцхайм, Баден-Вюртемберг, Германия) были спроектированы, фрезерованы и спечены до полной плотности с использованием системы CAD / CAM (Zenostar, Weiland Dental, Пфорцхайм, Баден-Вюртемберг, Германия). / P>

Культура клеток

Фибробласты десен человека (HGF) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Nutrient Mixture F-12), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% l-глутамина и 1% заменимых аминокислот в влажная атмосфера с 5% CO ₂ при 37 ° С. Среду меняли каждые 3 дня. Клетки удаляли из чашек для культивирования промыванием в фосфатно-солевом буфере (PBS) и инкубировали в растворе трипсин-ЭДТА. Клетки высевали на каждый тестовый субстрат в количестве 1 × 10 ⁵ . клеток / мл в одной среде для всех анализов.

Старение

Чтобы стимулировать условия жевания, механическое старение выполняли в искусственной слюне при 37 ° C, и нагрузка прикладывалась с использованием приспособления для трехточечного изгиба с частотой 2 Гц. Использовались следующие профили старения:нагрузка 80 Н и 10 ⁵ циклы для всех образцов [12, 13].

Жизнеспособность ячейки

Жизнеспособность HGF после воздействия нестареющих и состаренных G / Z и Y-TZP определяли через 2, 24, 48 и 72 часа (время воздействия) с использованием alamarBlue ^® анализ соли в виде 10% раствора в DMEM. Перед анализом все образцы были извлечены из HGF, а затем 500 мкл alamarBlue ^® краситель был добавлен с последующей инкубацией в течение 4 часов. Аликвоты (100 мкл) декантировали в 96-луночные чашки для культивирования клеток и определяли интенсивность флуоресценции при длинах волн возбуждения (530 нм) и испускания (580 нм) с помощью микропланшетного спектрофотометра Synergy ™ H4 (BioTek, Winooski, Vermont, USA). Все эксперименты проводили в трех экземплярах. Жизнеспособность клеток рассчитывалась следующим образом:жизнеспособность (%) =(поглощение обработанных лунок) / (поглощение контрольных лунок).

Окислительный стресс

Уровни активных форм кислорода (АФК) HGF, обработанного G / Z- и Y-TZP, до и после старения были идентифицированы с помощью хемилюминесценции с использованием набора для анализа активных форм кислорода (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Нанкин, Цзянсу).

Прилипание клеток

HGF культивировали в течение 2 часов на поверхности образцов G / Z и Y-TZP до и после старения. После фиксации ядра клеток окрашивали дигидрохлоридом 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (Yeasen, Шанхай, округ Шанхай, Китай). Изображения получали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа LSM 510 (Carl Zeiss, Jena, Tuttlingen, Германия). Прилипшие клетки анализировали в случайно выбранных областях в пяти срезах (450 мкм × 450 мкм) при увеличении × 200. Скорость клеточной адгезии определяли путем деления количества прикрепившихся клеток на общее количество засеянных клеток.>

Морфология клетки

HGF культивировали в течение 2 часов на неостаренных и состаренных поверхностях образцов G / Z до и после старения. После фиксации клетки окрашивали на нитчатый актин (F-актин), используя родамин фаллоидин (1:100 в 3% BSA в PBS). Изображения получали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа LSM 510 (Carl Zeiss, Jena, Tuttlingen, Германия). Образцы помещали на покровные стекла с использованием DAPI (Yeasen, Шанхай, округ Шанхай, Китай) для визуализации ядер клеток. Морфологию клеток на поверхностях G / Z и Y-TZP до и после старения также наблюдали с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) с XL-30 ESEM (Philips, Эйндховен, Северный Брабант, Нидерланды).

Тест на раздражение слизистой оболочки полости рта

Тест на раздражение слизистой оболочки полости рта проводился в соответствии с медицинскими стандартами Китайской Народной Республики YY / T 0127.13-2009. Для этого теста были отобраны десять мышей-самцов линии Wistar. Состаренный образец G / Z помещали в один защечный мешок для каждого животного в качестве тестируемого материала, тогда как образец G / Z без старения помещали на противоположную сторону в качестве контроля. Через 2 недели животных умерщвляли, и мешочки исследовали макроскопически после удаления дисков. Гистологические анализы слизистой оболочки щеки были дополнительно выполнены на криосрезов, окрашенных гематоксилином и эозином. Были получены средние оценки для всех макроскопических и микроскопических наблюдений. Среднее значение контрольной группы вычитали из среднего значения тестовой группы, чтобы получить индекс раздражения.

Статистический анализ

Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) использовался для объединенных (все времена воздействия) данных о жизнеспособности клеток, окислительном стрессе и скорости клеточной адгезии для оценки отдельных стоматологических образцов (SPSS 22.0; SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США. ).

Результаты

Градуированная структура слоя

Толщина градиентного слоя контролировалась примерно на уровне 0,9–1,0 мм. Структура и СЭМ-изображения системы G / Z показаны на рис. 1а, б. На рис. 1а, б изображена морфология, состоящая из следов остаточного стекла, зерен диоксида циркония, покрытых стеклом, и межкристаллитных пустот, которые создают морфологию поверхности, идеальную для увеличения прочности связи сердцевины и шпона. Кроме того, EDS-анализ градиентных слоев показан на рис. 1c, показывающий, что с увеличением расстояния от поверхности содержание элемента Zr увеличивалось, в то время как содержание элементов Si, Al и La уменьшалось. Подробности описаны в нашем предыдущем исследовании [4].

Физические и химические свойства G / Z. а Структурная схема. б СЭМ изображение. c EDS-анализ функционально-градуированного слоя

Жизнеспособность ячейки

Значительное снижение метаболизма в старых клетках, обработанных G / Z- и Y-TZP, наблюдалось через 72 часа ( P <0,00001) (рис. 2а). Не наблюдалось значительного метаболического снижения в старых клетках, обработанных G / Z, через 2 часа ( P =0,47), 24 часа ( P =0,82) и 48 часов ( P =0,53) (рис. 2а). Не наблюдалось значительного снижения метаболизма в старых клетках, обработанных Y-TZP, через 2 часа ( P =0,82), 24 часа ( P =0,32) и 48 часов ( P =0,54) (рис. 2а). Образцы G / Z не выявили каких-либо значительных различий в жизнеспособности клеток по сравнению с Y-TZP через 2 часа ( P =0,94), 24 часа ( P =0,86), 48 ч ( P =0,68) и 72 часа ( P =0,61) выдержки перед старением. Образцы G / Z не выявили каких-либо значительных различий в жизнеспособности клеток по сравнению с Y-TZP через 2 часа ( P =0,98), 24 часа ( P =0,54), 48 ч ( P =0,73) и 72 часа ( P =0,50) воздействия после старения.

Биосовместимость G / Z и Y-TZP до и после старения. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение, n =5. а Жизнеспособность клеток стареющего и нестареющего HGF, обработанного образцами. б Рос производство состаренных и необработанных образцов HGF. c Скорость адгезии клеток стареющего и нестареющего HGF, обработанного образцами. Значимость по сравнению с контрольной группой: ^# P <0,01; ^* P <0,05

Окислительный стресс

Данные по окислительному стрессу для старых клеток, обработанных G / Z- и Y-TZP, показали значительное увеличение через 72 часа ( P <0,00001, рис. 1б). Напротив, старые клетки, обработанные G / Z, не выявляли значительной разницы в продукции ROS через 2 часа ( P =0,91), 24 часа ( P =0,42) и 48 часов ( P =0,62). Кроме того, старые клетки, обработанные Y-TZP, не выявляли значимых различий в продукции ROS через 2 часа ( P =0,07), 24 часа ( P =0,40) и 48 часов ( P =0,53). Образцы G / Z не выявили каких-либо существенных различий в продукции ROS по сравнению с Y-TZP через 2 часа ( P =0,16), 24 часа ( P =0,79), 48 часов ( P =0,14) и 72 часа ( P =0,43) выдержки перед старением. Образцы G / Z не выявили каких-либо существенных различий в продукции ROS по сравнению с Y-TZP через 2 часа ( P =0,27), 24 часа ( P =0,17), 48 ч ( P =0,07) и 72 часа ( P =0,15) выдержки после старения.

Прилипание клеток

Скорость клеточной адгезии как G / Z, так и Y-TZP значительно увеличивалась после старения (рис. 2c). Скорости клеточной адгезии неостаренных G / Z и Y-TZP существенно не различались ( P =0,71) (рис. 2в). Скорости клеточной адгезии состаренных G / Z и Y-TZP существенно не различались ( P =0,71) (рис. 2в). Скорости клеточной адгезии G / Z и Y-TZP не показали значительных различий после старения ( P <0,00001) (рис. 2в). Характерные фотографии клеточной адгезии на Y-TZP и G / Z до и после старения показаны на рис. 3a – d.

Адгезия клеток к G / Z и Y-TZP до и после старения. а В возрасте G / Z. б Без старения G / Z. c в возрасте Y-TZP. г Несостаренный Y-TZP

Морфология клетки

Флуоресцентные изображения при разном времени инкубации показали, что клетки были прикреплены к G / Z-поверхностям; однако растекание было больше на состаренных поверхностях G / Z (рис. 4a – c), где клетки были сплющены и хорошо растянуты и имели многоугольную форму.

Присоединение, распространение и морфология HGF на G / Z до и после старения, наблюдаемых с помощью флуоресцентной микроскопии. а , b В возрасте G / Z. c Без старения G / Z. Клетки культивировали в течение 72 часов на субстратах, а затем фиксировали и окрашивали на нитчатый актин (F-актин, красный) и ядра (синий)

СЭМ-изображения показали, что клетки, культивированные на старых и неостаренных поверхностях G / Z, были значительно уплощены с расширениями или удлиненными телами и многочисленными микроворсинками (рис. 5a, b). Наблюдаются округлые ядра, подтверждающие прикрепление распространенной цитоплазмы клетки к поверхности образца (рис. 5а).

СЭМ-микрофотографии морфологии HGF на G / Z до и после старения через 72 часа после культивирования. а В возрасте G / Z. б Без старения G / Z. Исходное увеличение:× 2000

Тест на раздражение слизистой оболочки полости рта

Баллы макроскопических наблюдений как для исследуемой, так и для контралатеральной стороны были равны 0, что свидетельствует об отсутствии последующего раздражения. Кроме того, оценка под микроскопом для обеих сторон составила 0, что указывает на отсутствие явной реакции раздражения. На рис. 6a, b показано, что никаких гистопатологических изменений не наблюдалось в слизистой оболочке щеки, обработанной неостаренным G / Z и состаренным G / Z.

Патологическое исследование слизистой оболочки, обработанной старым G / Z ( a ) и невыдерживаемый G / Z ( b )

Обсуждение

Металлокерамические материалы все чаще заменяются материалами, не содержащими металлов, поскольку высвобождение ионов металлов широко обсуждается. Различные ионы металлов, включая серебро [14], золото [15], титан [16] и никель [17] зубных протезов, могут выделяться в слюну и плазму. McGinley et al. даже сообщили, что диффузные ионы Ni из стоматологического сплава Ni-Cr могут распространяться по эпителиальной ткани в базальную пластинку, а затем и по внеклеточному матриксу, что приводит к потере жизнеспособности клеток и целостности ткани [18]. Настоящие исследования в основном сосредоточены на разработке и улучшении всех керамических материалов. Поэтому G / Z был введен в нашем предыдущем исследовании [4] для повышения успешности материалов на основе диоксида циркония. Однако биосовместимость системы G / Z с учетом старения была неизвестна. Необходимы тесты на биосовместимость и умеренный контроль. Следовательно, была проведена серия тестов на биосовместимость, которые сравнили с золотым стандартом . , Y-TZP, с учетом старения. Кроме того, исследования показали, что топография поверхности, а также физические и химические свойства влияют на адгезию и жизнеспособность клеток [19]. Поэтому все образцы были подвергнуты пескоструйной очистке и полированию до клинической шероховатости поверхности.

Значительное снижение метаболизма в старых клетках, обработанных G / Z- и Y-TZP, наблюдалось через 72 часа (рис. 2а), что доказывает, что старение снижает пролиферацию клеток для G / Z и Y-TZP. Влияние старения на биосовместимость материалов из диоксида циркония является спорным. В предыдущем исследовании сообщалось о снижении биосовместимости диоксида циркония после старения [20]. Между тем, недавнее исследование доказало повышение биосовместимости состаренного диоксида циркония [21]. Различное влияние старения на биосовместимость может быть результатом разных процедур старения, включая цикл, температуру, нагрузку и частоту [22]. Влияние старения на изменения физических и химических свойств диоксида циркония зависит от агрессивности процедуры старения для разложения диоксида циркония. Для моделирования долгосрочных внутриротовых состояний процедура старения, использованная в этом исследовании, была основана на клинических параметрах, таких как нагрузка и частота укусов, использование влажной среды и температура человеческого тела [22]. / P>

Жизнеспособность клеток зависит от активности митохондрий. Уменьшение пролиферации клеток и увеличение продукции ROS может быть связано с диффузными ионами, распространяющимися по эпителиальной ткани в базальную пластинку, а затем по внеклеточному матриксу, что приводит к потере жизнеспособности клеток и целостности ткани [6, 23].

Скорость клеточной адгезии как G / Z, так и Y-TZP увеличивалась после старения (рис. 2c). Характерные фотографии клеточной адгезии на Y-TZP и G / Z до и после старения показаны на рис. 3a – d. Было проведено точное наблюдение прикрепления клеток на G / Z. Двухкомпонентное флуоресцентное окрашивание (рис. 4a, b) и изображения с помощью SEM (рис. 5a, b) продемонстрировали, что клетки, культивируемые как на старых, так и на старых G / Z, были сплющенными и хорошо распластанными.

Адгезия клеток зависит от физико-химических свойств биоматериала. Общеизвестно, что миграция и адгезия являются биологическими параметрами, которые не обязательно напрямую связаны. Клетки могут медленно мигрировать с очень высокой адгезией [24, 25]. Аль Кахтани и др. [26] также сообщили, что поверхность Y-TZP после пескоструйной обработки демонстрирует более высокую клеточную адгезию, но низкую пролиферацию клеток при инкубации с остеобластами Saos-2. Смачиваемость поверхности является фактором, который также определяет предпочтение клеточной адгезии посредством регулирования количества белка, адсорбированного на поверхности [27]. Сообщалось, что клетки на супергидрофильной поверхности даже начали пролиферацию, как только адгезия была завершена, и это явление было тесно связано с большим количеством белка, адсорбированного на гидрофильной поверхности [28]. Истирание при старении G / Z и Y-TZP обеспечивает шероховатую поверхность с высокой смачиваемостью, что обеспечивает прочную адгезию клеток. Этот тип поверхности будет оптимальным для адгезии десен вокруг опорных поверхностей. В отличие от этого, гладкие поверхности придают материалам ограниченные адгезионные свойства, что подходит для поверхностей, предназначенных для предотвращения образования биопленки в септической среде полости рта [29]. Таким образом, истирание G / Z и Y-TZP в качестве материалов для зубных протезов увеличивает вероятность образования биопленки. Скорости клеточной адгезии G / Z и Y-TZP не показали значительных различий до и после старения (рис. 2c). Это открытие доказало, что G / Z и Y-TZP проявляют сходные свойства прикрепления клеток до и после старения, что указывает на многообещающие поверхностные биологические свойства G / Z.

Тесты на раздражение in vivo имеют решающее значение для длительного применения медицинских устройств для полости рта. При этом никаких макроскопических или микроскопических патологических изменений слизистой оболочки, обработанной G / Z, не наблюдалось (рис. 6a, b).

Наличие большого количества м -ZrO ₂ может привести к снижению прочности диоксида циркония. Надежная биосовместимость системы G / Z может быть связана с небольшим изменением фазы во время процедуры инфильтрации, что было доказано в нашем предыдущем исследовании [4]. Другое исследование доказало хорошую стойкость к старению инфильтрированных материалов Y-TZP. Inokoshi et al. [30] сообщили, что Al ₂ О ₃ -инфильтрованный Y-TZP был гидротермально стабилен после старения благодаря высокому количеству c-ZrO ₂ фазы на межслойной поверхности, хотя она имеет более высокую начальную моноклинную объемную долю по сравнению с Y-TZP.

Несколько исследований подтвердили надежную биосовместимость композиции стекло-цирконий. Клетки, подобные фибробластам L-929 и остеобластам Saos-2, демонстрируют хорошую адгезию и пролиферацию на поверхности HAp-Al ₂ О ₃ -ZrO ₂ (FGM), что свидетельствует о хорошей биосовместимости FGM [31]. Стакан (Na ₂ O-SiO ₂ -B ₂ О ₃ -CaO) -Hap-ZrO ₂ Материал имплантата показал лучшее сцепление с костью, чем материал имплантата из титана, после 3-месячного периода имплантации в кость ноги собаки [32]. Ли и др. сообщили, что материал стекло-диоксид циркония проявляет хорошую биоактивность и отсутствие цитотоксичности [33]. В самых недавних исследованиях сообщалось о уплотненной гранулированной композиции стекло-диоксид циркония с многообещающими механическими свойствами и эстетикой [10, 11, 34]. Однако о биосовместимости дифференцированной композиции стекло-цирконий не сообщалось.

Выводы

Согласно тесту на раздражение слизистой оболочки полости рта в сочетании с анализом жизнеспособности клеток, клеточной адгезии, морфологии клеток и реакций на окислительный стресс, биосовместимость G / Z сравнима с биосовместимостью Y-TZP как до, так и после старения. В качестве материала для зубных протезов G / Z имеет многообещающее будущее в клинических применениях. Однако это исследование является предварительным отчетом, и для подтверждения настоящих результатов необходимы дальнейшие исследования in vivo и in vitro с использованием более всеобъемлющих методов тестирования.

Сокращения

DAPI:

4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид

F-actin:

Нитчатый актин

КОЖПО:

HAp-Al ₂ О ₃ -ZrO ₂

G / Z:

Градиентное наностекло / диоксид циркония

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

т-м:

Тетрагональный в моноклинный

Y-TZP:

Тетрагональный поликристалл диоксида циркония, стабилизированный иттрием