Изучение роли размера капель эмульсии и поверхностно-активного вещества в процессе изготовления мицеллярных нанокристаллов на основе межфазной нестабильности

Фон

Возможности применения наноматериалов, таких как флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы (квантовые точки, КТ) [1,2,3], суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (SPION) [4,5,6] и наночастицы золота [7,8,9] , для биомедицинского обнаружения, визуализации и терапии хорошо зарекомендовала себя после почти двух десятилетий исследований [10, 11]. Таким образом, в последние годы фокус исследований нанобиоматериалов сместился с экспериментов по проверке концепции на механистические исследования, которые направлены на получение понимания и систематического понимания процессов производства наноматериалов, взаимосвязей структуры наноматериалов и их свойств, а также взаимодействия наноматериалов и биосистем. , а также трансляционные исследования, целью которых является выявление и решение ключевых проблем в области внедрения наноматериалов в промышленность и клинику. Настоящая работа направлена ​​на получение нового понимания возникающего процесса изготовления, известного как метод межфазной нестабильности, мицеллярных нанокристаллов, которые стали основным классом нанобиоматериалов.

Основная стратегия солюбилизации гидрофобных наноматериалов (например, квантовых точек, SPION и наночастиц золота, синтезированных с помощью широко используемого высокотемпературного синтеза на основе органических растворителей [12,13,14]) в воде заключается в использовании мицелл для инкапсуляции гидрофобных наноматериалов [ 15,16,17]. Мицеллы - это классическая система самосборки, в которой амфифильные молекулы спонтанно образуют структуру ядро-оболочка (называемая мицеллой) в водной среде, причем гидрофильный сегмент амфифильных молекул обращен наружу, как оболочка мицеллы, а гидрофобный сегмент обращен к внутрь, как ядро ​​мицеллы, чтобы минимизировать общую энергию системы. Мицеллы имеют долгую историю применения в качестве чистящих средств и систем доставки лекарств [18,19,20,21,22], в основном благодаря тому факту, что гидрофобные молекулы (например, масла, многие противораковые препараты) могут быть инкапсулированы в гидрофобные ядра. мицелл, в первую очередь, за счет гидрофобного взаимодействия [23]. Совсем недавно мицеллы стали применяться для инкапсуляции одиночных нанокристаллов (каждая мицелла инкапсулирует единственный нанокристалл) для биомедицинской визуализации и обнаружения [24]. Совсем недавно довольно много исследовательских групп сообщили об использовании мицелл для инкапсуляции множества нанокристаллов, для многофункциональности или синергетических эффектов между различными нанокристаллами в мицелле [25,26,27,28,29,30,31,32].

Возникающим методом получения мицеллярных нанокристаллов (мицелл, инкапсулированных в нанокристаллы) является метод межфазной нестабильности [33,34,35]. Процесс межфазной нестабильности был впервые описан в 2008 г. Жу и Хейворд при получении мицелл, инкапсулированных наночастицами оксида железа [33], и позже был использован Ruan и Winter et al. подготовить мицеллы, инкапсулирующие как КТ, так и SPION в 2010 г., и мицеллы, инкапсулирующие КТ разных цветов флуоресцентного излучения в 2011 г. [25, 26]. Процесс межфазной нестабильности для получения мицелл поли (стирол-б-этиленгликоль) (ПС-ПЭГ) с инкапсулированными квантовыми точками включает два основных этапа:(1) образование капель эмульсии масло-в-воде. В этой эмульсии масляная фаза содержит гидрофобные КТ и амфифильный блок-сополимер ПС-ПЭГ, растворенный в неполярном органическом растворителе (хлороформ в настоящей работе); водная фаза содержит растворенное в воде поверхностно-активное вещество поли (виниловый спирт) (ПВС); (2) Образование мицелл, заключенных в нанокристаллы. После испарения органического растворителя граница раздела масло / вода эмульсии становится нестабильной, и гидрофобное взаимодействие заставляет систему спонтанно формировать мицеллы PS-PEG, инкапсулирующие гидрофобные QD. Простым индикатором успешного образования мицелл, обычно используемых в экспериментах, является резкое визуальное преобразование системы из молочной дисперсии (эмульсии) в прозрачную (дисперсия мицеллярных нанокристаллов) благодаря нанометровому размеру (типичный диаметр 30-40 нм). ) мицелл. В предыдущих экспериментах Руана и Винтера с инкапсулированием КТ в мицеллы ПС-ПЭГ с использованием процесса межфазной нестабильности было обнаружено, что, хотя этот процесс имел много положительных особенностей, главной проблемой была часто наблюдаемая большая потеря флуоресценции КТ в системе во время процесс изготовления / хранения, и причина потери флуоресценции была неизвестна. Цели данной работы двояки:с одной стороны, мы стремимся минимизировать потерю флуоресценции инкапсулированных в QD мицелл PS-PEG, полученных в результате процесса межфазной нестабильности; с другой стороны, с помощью процесса оптимизации технологии и использования флуоресценции квантовых точек в качестве репортера для отслеживания процесса изготовления нанокомпозитных материалов, содержащих квантовые точки, мы стремимся получить новое понимание возникающего общего процесса получения мицелл, инкапсулированных в нанокристаллы. , т.е. процесс межфазной неустойчивости. Наши результаты предполагают, что размер капель эмульсии и поверхностно-активное вещество ПВС играют ключевую роль в процессе изготовления:каждая капля эмульсии по существу функционирует как «микрореактор», в котором происходят межфазная нестабильность и «реакции» самосборки, при этом поверхностно-активное вещество ПВС является требуется для формирования «микрореакторов»; Использование большого размера «микрореактора» (~ 25 мкм) приводит к большой части коллоидно нестабильных нанокристаллических инкапсулированных мицелл ПВС в дополнение к коллоидно стабильным нанокристаллическим инкапсулированным мицеллам ПС-ПЭГ, при использовании небольшого размера «микрореактора» (~ 3 мкм или меньше, генерируется ультразвуком или электрораспылением) приводит только к коллоидно стабильным нанокристаллическим инкапсулированным мицеллам PS-PEG.

Методы

Материалы

Квантовые точки CdSe / ZnS типа ядро-оболочка (КТ, длина волны излучения 600 нм, покрытые октадециламином) были приобретены у Ocean Nanotech. Поли (стирол-b-этиленгликоль) (PS-PEG) и поли (стирол-b-этиленгликоль) с концевыми группами карбоновой кислоты (PS-PEG-COOH) (PS 9,5 k Дальтон, PEG 18,0 k Дальтон) были приобретены у Polymer Source. . Поли (виниловый спирт) (ПВС) (молекулярная масса 13–23 кг / моль, гидролизованный на 87–89%) был приобретен у Sigma-Aldrich. Пептид Tat (последовательность YGRKKRRQRRR) и пептид RGD (Arg-Gly-Asp) были приобретены у ChinaPeptides. Гидрохлорид 1-этил-3 - (- 3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) и сульфо-NHS ​​были приобретены у Sigma-Aldrich. Все остальные химические вещества были реактивными. Вода, используемая для всех экспериментов, была дважды дистиллирована и очищена с помощью системы очистки Millipore Milli-Q.

Получение мицеллярных нанокристаллов с помощью процесса межфазной нестабильности

В типичной процедуре масляную фазу сначала формировали путем смешивания QD (0,1 мкМ, 0,1 мл) и PS-PEG (10 мг / мл, 20 мкл) в хлороформе органического растворителя. После этого добавляли водную фазу (0,6 мл воды, содержащей 5 мг / мл ПВС). Эмульсия типа масло в воде была образована либо ручным встряхиванием (энергично встряхивая смесь вручную в течение 1 мин), либо обработкой ультразвуком (обработка смеси ультразвуком в ультразвуковом устройстве для ванны ShuMei KQ218 в течение 30 с). В некоторых экспериментах электрораспыление использовалось для создания ультратонких капель эмульсии для процесса межфазной нестабильности [35]. Для получения капель эмульсии с разными размерами для изучения влияния размера капель использовались разные методы обработки:капли ~ 25 мкм (в диаметре) были сформированы ручным встряхиванием, капли ~ 3 мкм (в диаметре) были сформированы обработкой ультразвуком, а несколько Капли от сотен нанометров до нескольких микрометров (в диаметре) образовывались электрораспылением. Эмульсию дополнительно разбавляли в четыре раза сверхчистой водой (2,4 мл). Эмульсию оставляли в вытяжном шкафу с магнитной мешалкой при 100 об / мин, чтобы дать возможность испарению хлороформа, что привело к образованию мицеллярных квантовых точек. Видимый переход от молочной дисперсии к прозрачной свидетельствует об успешном образовании мицелл.

Когда в качестве органического растворителя использовали тетрагидрофуран (THF), сначала образовывалась масляная фаза путем смешивания QD (0,1 мкМ, 1 мл) и PS-PEG (10 мг / мл, 0,2 мл) в THF. Деионизированная вода добавлялась к раствору по каплям (1 капля / 20 с) до тех пор, пока содержание воды не достигало 50% v / v . Затем раствор перемешивали путем голосования в течение 10–15 минут и затем диализовали против деионизированной воды в течение 2 дней для удаления ТГФ (отсечка по молекулярной массе 100 000 дальтон).

Когда электрораспыление использовалось для создания капель для процесса межфазной нестабильности, операция была следующей [35]. Использовалась коаксиальная конфигурация электрораспыления. Внутренняя капиллярная игла представляла собой капилляр из нержавеющей стали 27 калибра (внешний диаметр 500 мкм; внутренний диаметр 300 мкм), а внешняя игла представляла собой трехходовой соединитель из нержавеющей стали 20 калибра (внешний диаметр 1000 мкм; внутренний диаметр 500 мкм). Наконечник сопла располагался на 0,8 см над заземленным стальным кольцом и на 10 см над стеклянной чашей для сбора. Масляная фаза образовывалась путем смешивания КТ и ПС-ПЭГ и затем подавалась во внутренний капилляр из нержавеющей стали со скоростью 0,6 мл / ч с помощью шприцевого насоса (SPLab01, Шэньчжэнь, Китай). Концентрации PS-PEG и QD в масляной фазе составляли 5 мг / мл и 0,2 мкМ соответственно. Водную фазу получали растворением ПВС в деионизированном H ₂ . O при 40 мг / мл. Водный раствор подавали к внешнему кольцу коаксиальной иглы со скоростью 1,5 мл / ч с помощью второго шприцевого насоса (SPLab01, Шэньчжэнь, Китай). Обычно при напряжении в диапазоне 6–7 кВ на кончике коаксиального сопла наблюдалась вогнутая коническая струя (конус Тейлора). Стеклянная чаша для сбора, содержащая 10 мл деионизированной воды, была помещена под наконечник сопла для сбора капель. Время электрораспыления (после формирования стабильного конуса Тейлора) обычно составляло 30–90 мин. После этого следовало дальнейшее испарение в химическом вытяжном шкафу в течение ночи. Наконец, дисперсия из стеклянной чашки для сбора была перенесена в центрифужную пробирку на 15 мл для анализа.

Характеристики физических свойств мицеллярных квантовых точек

Морфология мицеллярных КТ была охарактеризована с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ, JEOL JEM-2100 (HR)), и все образцы, исследованные с помощью ПЭМ в настоящей работе, были отрицательно окрашены 1% фосфорновольфрамовой кислоты (ФТА). Размер частиц характеризовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа или динамического рассеяния света (DLS). Спектры флуоресценции были получены на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi F-4600.

Цитотоксичность наноматериалов

Исследование цитотоксичности проводили на трех хорошо охарактеризованных линиях раковых клеток человека, а именно на клетках A549 (альвеолярный базальный эпителий), MCF-7 (грудь) и HeLa (шейка матки) (приобретенных у KeyGen Biotech, Китай). Клетки поддерживали культивированной средой DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой и антибиотиками (пенициллин / стрептомицин) во влажном инкубаторе (37 ° C и 5% CO ₂ ). Для оценки цитотоксичности клетки высевали на 96-луночные планшеты в 200 мкл среды на 24 часа. Затем клетки инкубировали с различными концентрациями мицеллярных КТ в свежей культуральной среде при 37 ° C в 5% CO ₂ Атмосфера. После 24 ч инкубации культуральную среду с диспергированными мицеллярными QD удаляли и проводили анализ МТТ в соответствии с протоколом производителя. Наконец, оптическое поглощение в каждой лунке измеряли при 570 нм с помощью устройства для считывания микротитровальных планшетов.

Конъюгация инкапсулированных в QD мицелл PS-PEG-COOH с пептидами

Мицеллы PS-PEG-COOH получали с помощью описанной выше процедуры межфазной нестабильности с использованием молекул PS-PEG-COOH вместо молекул PS-PEG. Затем проводили конъюгацию с пептидом Tat или пептидом RGD с помощью метода EDC / сульфо-NHS. Для активации карбоксильных групп мицелл к дисперсии мицелл (3 мл) добавляли 0,3 мл 0,1 М буферного раствора MES, содержащего 2 мг / мл EDC и 5 мг / мл сульфо-NHS, и проводили реакцию без перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре. . Затем лишний EDC и сульфо-NHS ​​удаляли с помощью ультрафильтрационной трубки 30 кДа (центрифугирование со скоростью 10 оборотов в минуту в течение 5 минут), и полученную дисперсию ресуспендировали в PBS (1 мл). Затем добавляли 50 мкл пептида Tat (2 мг / мл в PBS) или 50 мкл пептида RGD (0,5 мг / мл в PBS) и проводили реакцию в течение 12 ч при 4 ° C соответственно. Полученную дисперсию конъюгированных с пептидом мицеллярных квантовых точек PS-PEG очищали с использованием ультрафильтрационной трубки 50 кДа (центрифугирование со скоростью 10 оборотов в минуту в течение 5 минут) три раза для удаления лишних молекул пептида и ресуспендировали в PBS (1 мл).

Получение изображений живых клеток

Визуализацию живых клеток использовали для изучения клеточной интернализации и внутриклеточного транспорта конъюгированных с Tat-пептидом мицеллярных QD PS-PEG. Клетки HeLa (приобретенные у KeyGen Biotech, Китай) высевали на планшеты для культивирования тканей со стеклянным дном при начальном слиянии 20% (плотность посева 1 × 10 ⁵ клеток / мл) в 600 мкл среды (DMEM + 10% фетальная бычья сыворотка) и культивировали в течение 40 ч в 5% CO ₂ при 37 ° С. Затем добавляли конъюгированные с Tat-пептидом мицеллярные QD PS-PEG (10 нМ QD в среде для культивирования клеток). После инкубации с мицеллярными квантовыми точками в течение 1 часа клетки дважды промывали свежей культуральной средой для удаления свободных мицеллярных квантовых точек (этап промывки выполняли для того, чтобы время начала внутриклеточного транспорта интернализованных мицеллярных квантовых точек могло быть примерно равным то же самое для всех добавленных наночастиц). Через 6 ч каждая пластина клеток была визуализирована системой визуализации живых клеток, которая состоит из камеры инкубации клеток (IX3W, Tokai Hit), эпифлуоресцентного микроскопа (IX-83, Olympus, с галогенной лампой в качестве источника света). ), конфокальной системы с вращающимся диском (Andor) и камеры электронного умножителя с зарядовой связью (EMCCD) (Evolve 512, Photometrics). Используемая здесь конфокальная система визуализации живых клеток позволяет получать конфокальные изображения с вращающимся диском живых клеток, культивируемых на предметном столике микроскопа, что особенно полезно для изучения процесса клеточного транспорта. Сохраняя живые клетки в культуре на предметном столике микроскопа, можно гарантировать, что естественный биологический процесс отслеживается с минимальными нарушениями. Чтобы противодействовать окрашиванию ядра клетки, непосредственно перед визуализацией (в определенный момент времени клеточного транспорта) флуоресцентный краситель Hoechst 33342 (5 мкМ в среде для культивирования клеток) инкубировали с живыми клетками в течение 20 минут.

Визуализация живых клеток также применялась для изучения специфического связывания конъюгированных с RGD пептидом мицеллярных квантовых точек PS-PEG с α _v β ₃ -интегриновые молекулы, используя α _v β ₃ -интегрин сверхэкспрессируемая клеточная линия (клетки U87 MG, закупленные у KeyGen Biotech, Китай) по сравнению с клеточной линией без α _v β ₃ сверхэкспрессия интегрина (клетки MCF-7, приобретенные у KeyGen Biotech, Китай). Вышеупомянутый протокол клеточной визуализации, используемый для мицеллярных QD, конъюгированных с Tat-пептидом, PS-PEG, был принят, с основной модификацией, заключающейся в том, что концентрация, используемая для RGD-пептид-конъюгированных мицеллярных QD, составляла 100 нМ (QD в среде для культивирования клеток).

Результаты и обсуждение

Мы и другие недавно ввели метод межфазной нестабильности для инкапсуляции нанокристаллов с целью формирования композитных наночастиц для биологических применений. Однако мы часто сталкивались с невоспроизводимыми, а иногда и противоречивыми результатами по интенсивности флуоресценции квантовых точек (здесь квантовые точки использовались в качестве модели нанокристаллов). Этот вопрос необходимо решить для перевода в промышленность и клинику. Многие факторы (например, растворитель, полимер, температура, размер «микрореактора»), задействованные в процессе изготовления, могут привести к потере флуоресценции и невоспроизводимым результатам. Мы исследовали различные вовлеченные факторы и обнаружили, что размер «микрореактора» (капли эмульсии) является ключевым фактором в этом отношении, а использование поверхностно-активного вещества ПВС является тесно связанным с этим фактором. Ниже мы в первую очередь описываем результаты по влиянию размера капель эмульсии, а также поверхностно-активного вещества ПВС.

Мы сравнили эффекты двух различных методов эмульгирования с сильно различающейся механической прочностью, а именно ручного встряхивания (энергичное встряхивание смеси вручную) и обработки ультразвуком в ванне (обработка смеси ультразвуком в ультразвуковом устройстве для ванны). Мы обнаружили, что оба этих метода могут в конечном итоге привести к прозрачным и гомогенным дисперсиям после испарения органического растворителя, что указывает на успешное образование мицелл с инкапсулированными нанокристаллами (рис. 1b, c, внизу). Поскольку прозрачный и однородный внешний вид обычно используется в качестве простого и удобного индикатора успешного образования мицелл в процессе изготовления на основе межфазной нестабильности, потенциальное влияние различных методов эмульгирования на мицеллярный продукт ранее не учитывалось. Мы использовали световую микроскопию для изучения размеров капель эмульсии, образованных этими двумя различными методами эмульгирования, соответственно, и обнаружили, что метод ручного встряхивания привел к образованию капель ~ 25 мкм (в диаметре), в то время как метод обработки ультразвуком в ванне привел к ~ 3 мкм ( в диаметре) (рис. 1б, в, вверху). Приблизительно размеры 500 капель были измерены для каждого образца с использованием изображений световой микроскопии, чтобы получить средний размер и распределение по размерам. Статистический анализ ( t Стьюдента test) показывает, что разница между средним размером капель, образованных при ручном встряхивании (~ 25 мкм) и при обработке ультразвуком (~ 3 мкм), была статистически значимой ( P <0,001). Важно отметить, что мы также провели контрольные эксперименты, чтобы подтвердить, что эти два разных метода эмульгирования постоянно приводят к образованию капель эмульсии в двух вышеупомянутых диапазонах размеров, соответственно:ручное встряхивание с несколькими разными временами (0,5, 1, 2 и 3 мин), все в результате в каплях эмульсии размером ~ 25 мкм (с аналогичным распределением по размерам) и обработка ультразвуком в ванне с несколькими разными временными интервалами (0,5, 1 и 2 мин) - все это привело к образованию капель эмульсии размером ~ 3 мкм (с аналогичным распределением по размерам, Дополнительный файл 1:Рисунок S1) .

Визуальное наблюдение за каплями эмульсии и полученными мицеллами, заключенными в КТ, после испарения органического растворителя. а ПВА не использовался. Образовалось мало или совсем не образовалось капель эмульсии ( верхнее изображение ); После удаления органического растворителя образовалось мало или совсем не было мицелл, инкапсулированных в КТ ( нижнее изображение , вставка показывает соответствующее флуоресцентное изображение с использованием ручной УФ-лампы для возбуждения красного Флуоресценция QD). б Для образования капель эмульсии использовали ручное встряхивание. Образовались капли эмульсии размером ~ 25 мкм ( верхнее изображение , вставка показывает результат измерения размера капель из анализа изображения 500 капель). Кроме того, изменение размера из-за разного времени встряхивания оказалось минимальным (рис. S1). После удаления органического растворителя образовалась прозрачная и гомогенная дисперсия, что свидетельствует об успешном образовании мицелл, заключенных в нанокристаллы ( нижнее изображение , вставка показывает соответствующее флуоресцентное изображение с использованием ручной УФ-лампы для возбуждения красного Флуоресценция QD). c Обработка ультразвуком в ванне использовалась для образования капель эмульсии. Образовались капли эмульсии размером ~ 3 мкм ( верхнее изображение , вставка показывает результат измерения размера капель из анализа изображения 500 капель). Кроме того, изменение размера из-за разного времени встряхивания оказалось минимальным (рис. S1). После удаления органического растворителя образовалась прозрачная и гомогенная дисперсия, что свидетельствует об успешном образовании инкапсулированных в нанокристаллы мицелл ( нижнее изображение , вставка показывает соответствующее флуоресцентное изображение с использованием ручной УФ-лампы для возбуждения красного Флуоресценция QD). Чтобы проанализировать размер капель эмульсии конкретного образца, сначала было получено изображение капель эмульсии с помощью световой микроскопии, а затем с помощью бесплатного программного обеспечения ImageJ были измерены диаметры ~ 500 капель для получения среднего размера и распределения по размерам капли эмульсии образца

Кроме того, мы также провели эмульсионную обработку в отсутствие поверхностно-активного вещества ПВС и обнаружили, что практически не образовывались капли эмульсии, судя по результатам световой микроскопии (рис. 1а, вверху), и практически не было успешно образованных мицелл, судя по результатам исследования. наблюдение почти полного фазового разделения (осаждение квантовых точек) в конечном продукте, т. е. невозможности образования мицеллярного продукта (рис. 1а, внизу). Результаты на рис. 1а предполагают, что поверхностно-активное вещество ПВС требуется в процессе межфазной нестабильности для успешного образования капель эмульсии (как «микрореакторы») и мицелл (как конечных продуктов). Это нетривиально, поскольку предполагает, что, хотя ПС-ПЭГ также является амфифильным по природе, присутствие одного ПС-ПЭГ (без присутствия ПВС) в системе не может дать капельки эмульсии, необходимых для процесса межфазной нестабильности. / P>

Хотя дисперсии продукта оказались прозрачными и гомогенными сразу после их образования (результаты ПЭМ и DLS-характеризации показали сферические и монодисперсные мицеллы, инкапсулированные квантовыми точками, Дополнительный файл 2:Рисунок S2), разница в размерах капель эмульсии, представленная двумя указанными выше разными Было обнаружено, что методы эмульгирования, а именно ручное встряхивание и обработка ультразвуком, приводят к большим различиям в продуктах мицеллярных нанокристаллов. Мы измерили и проследили за изменением интенсивности флуоресценции мицеллярных QD (QD-инкапсулированных мицелл), образованных вручную встряхиванием и обработкой ультразвуком, соответственно, в течение периода времени 40 дней при 4 ° C. Мы обнаружили, что для мицелл КТ, сформированные вручную встряхиванием (в течение 1 мин, сформированные из капель эмульсии размером ~ 25 мкм), хотя интенсивность флуоресценции (измеренная с помощью флуоресцентной спектроскопии) сохранялась во время процесса мицеллообразования с течением времени (~ 10 дней) интенсивность флуоресценции мицеллярных квантовых точек постепенно снижалась только примерно до 50% от исходного уровня интенсивности флуоресценции и впоследствии оставалась стабильной (рис. 2а). Напротив, мицеллярные квантовые точки, сформированные в результате обработки ультразвуком (в течение 30 с, сформированные из капель эмульсии размером ~ 3 мкм), в основном сохраняли интенсивность флуоресценции (измеренную с помощью флуоресцентной спектроскопии) в течение всего периода времени (рис. 2а). Кроме того, мы невооруженным глазом наблюдали за нижней частью дисперсий мицеллярных квантовых точек, образованных путем ручного встряхивания и обработки ультразвуком, соответственно, после того, как образцы оставались стоять в течение 10 дней при 4 ° C. В нижней части мицеллярной дисперсии КТ, образовавшейся при ручном встряхивании (в течение 1 мин) после 10 дней хранения, невооруженным глазом наблюдался видимый осадок (рис. 2а, вставка). Напротив, в нижней части мицеллярных дисперсий КТ, образованных обработкой ультразвуком (в течение 30 с) после 10 дней хранения, невооруженным глазом не наблюдалось видимого осадка (рис. 2а, вставка). Эти результаты предполагают, что, хотя оба метода эмульгирования могут привести к успешному образованию инкапсулированных КТ мицелл с аналогичной эффективностью инкапсуляции, большая часть инкапсулированных КТ мицелл образована более крупными каплями эмульсии (~ 25 мкм, полученными путем ручного встряхивания в течение 1 мин. ) был коллоидно нестабилен и со временем приводил к осаждению и, таким образом, к потере флуоресценции из дисперсии, в то время как все мицеллы, заключенные в КТ, образованные меньшими каплями эмульсии (~ 3 мкм, полученные обработкой ультразвуком в ванне в течение 30 с), были коллоидно стабильными и, таким образом, сохранялись. флуоресценция в течение длительного периода времени (ПЭМ-исследование дисперсии после 10-дневного хранения также показало хорошо сохраняющуюся морфологию мицеллярных нанокристаллов, как показано в Дополнительном файле 3:Рисунок S3). Кроме того, мы обнаружили, что при увеличении времени обработки ультразвуком с 30 с до 1 и 2 мин для образования капель эмульсии интенсивность флуоресценции резко снижалась, хотя мицеллы, инкапсулированные в КТ, были коллоидно стабильными в течение длительного периода времени для различных продолжительность обработки ультразвуком, судя по стабильной интенсивности флуоресценции на протяжении всего времени хранения (рис. 2b). Потеря флуоресценции, показанная на рис. 2б, вероятно, была вызвана образованием поверхностных дефектов на КТ в результате сильной и продолжительной механической обработки. В контрольном эксперименте было обнаружено, что интенсивность флуоресценции гидрофобных КТ, растворенных в хлороформе, постепенно уменьшается при обработке ультразвуком с увеличением времени обработки ультразвуком (дополнительный файл 4:Рисунок S4), что подтверждает эту предложенную причину потери флуоресценции. В совокупности рис. 2a, b показывает два основных механизма потери флуоресценции в системе мицелл, инкапсулированных квантовыми точками, созданную в результате процесса межфазной нестабильности, а именно коллоидно нестабильные мицеллы, инкапсулированные в QD, и дефекты поверхности квантовых точек, вызванные механической обработкой.

Флуоресцентная стабильность мицелл, инкапсулированных в QD, полученных в результате процесса межфазной нестабильности. а Изменение интенсивности флуоресценции (измеренной с помощью флуоресцентной спектроскопии) с течением времени для мицелл, инкапсулированных КТ, при этом капли эмульсии образуются либо путем ручного встряхивания (в течение 1 мин, т. Е. Капли ~ 25 мкм) или обработки ультразвуком (в течение 30 с, т. Е. ~ 3 мкм капель) соответственно. вставки представляют собой изображения дисперсий мицелл с инкапсулированными квантовыми точками после 10 дней хранения при 4 ° C с каплями эмульсии, образованными либо путем ручного встряхивания (в течение 1 мин, т. е. капли ~ 25 мкм) или обработки ультразвуком (в течение 30 с, т. е. ~ 3 мкм капель) соответственно. Панель a указывает на то, что одной из причин потери флуоресценции мицелл, инкапсулированных QD, является присутствие коллоидно нестабильных мицелл, инкапсулированных QD. б Изменение интенсивности флуоресценции (измеренной с помощью флуоресцентной спектроскопии) во времени для инкапсулированных квантовыми точками мицелл с каплями эмульсии, образованными в результате обработки ультразвуком (т.е. капли ~ 3 мкм) для трех различных длительностей обработки ультразвуком. Панель b указывает на то, что одной из причин потери флуоресценции мицелл, инкапсулированных КТ, являются поверхностные дефекты КТ, возникающие в результате сильной и продолжительной механической обработки

Среди этих двух механизмов потери флуоресценции, хотя хорошо известно, что потеря флуоресценции КТ может быть вызвана повреждением поверхности КТ, результат, заключающийся в том, что часть мицелл является коллоидно нестабильной, стал для нас сюрпризом. Таким образом, мы провели дальнейшее изучение этого конкретного механизма. Сначала мы задались вопросом, действительно ли вышеупомянутые осажденные КТ инкапсулированы в мицеллы (или мицеллоподобные структуры сборки). Мы обнаружили, что простое встряхивание дисперсии с этими осадками может привести к возвращению интенсивности флуоресценции дисперсии на исходный уровень (рис. 3а, слева); Напротив, контрольное исследование с использованием такой же обработки для гидрофобных КТ, осажденных в воде, не показало такого увеличения интенсивности флуоресценции (рис. 3а, справа). Кроме того, изображения с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) нижней части образцов продукта, сформированных путем ручного встряхивания после 10 дней хранения, показали большое количество КТ, сгруппированных в большие сферические и несферические структуры (рис. 3b, слева); Напротив, в нижней части образцов продукта, сформированных обработкой ультразвуком после 10 дней хранения, соответствующие изображения ПЭМ показали только небольшое количество квантовых точек, сгруппированных в сферическую структуру (рис. 3b, посередине). Таким образом, эти результаты показывают, что осажденные КТ действительно были инкапсулированы в мицеллы или мицеллоподобные структуры сборки, то есть эти КТ не были голыми гидрофобными КТ. Затем мы задали вопрос, какова химическая природа этих коллоидно нестабильных мицелл (или мицеллоподобных структур сборки). Поскольку мицелла PS-PEG должна быть коллоидно стабильной, мы предположили, что нестабильные мицеллы (или мицеллоподобные структуры сборки) были сформированы сурфактантом PVA. Эта гипотеза подтверждается двумя следующими экспериментальными данными. Во-первых, мы обнаружили, что использование ПВС без ПС-ПЭГ в процессе межфазной нестабильности действительно может привести к мицеллам, инкапсулирующим КТ (рис. 3b, справа). Во-вторых, мы провели эксперименты по диализу на мицеллярных КТ ПС-ПЭГ и мицеллярных КТ ПВС, соответственно, для сравнения. После диализной обработки (с отсечкой по молекулярной массе диализного мешка, равной 200 кДа, что больше, чем молекулярная масса ПВС и ПС-ПЭГ) относительно чистой воды, мицеллярные КТ ПС-ПЭГ оставались коллоидно стабильными, судя по тому факту, что флуоресценция КТ оставалась однородной в дисперсии (рис. 3в, слева). В отличие от этого, дисперсия мицеллярных квантовых точек ПВС привела к четко видимым флуоресцентным агрегатам после почти идентичной диализной обработки, как указано выше (рис. 3с, справа). As the dialysis experiment could be considered as mimicking the dilution treatment that micelle-based nanomaterials would encounter once introduced to an in vivo environment, our dialysis experimental results indicate that the QD-encapsulated PVA micelles would become colloidally unstable in vivo. Therefore, the results shown in Fig. 3c suggest that the fluorescence loss from using large emulsion droplets (~25 μm, produced by manual shaking) is caused by colloidally unstable PVA micelles (or other micelle-like assembly structures) encapsulating QDs.

Examining the colloidally unstable part of the micellar QDs. а Влево , the disappearance of fluorescence of the colloidally unstable part of the micellar QDs from the dispersion after 10-day storage could be resumed after the dispersion was shaken. Right , the fluorescence of hydrophobic QDs was not detected in water because they could not be dispersed in water. б Влево and middle are the TEM images of the bottom portions of the micellar QD dispersions formed from manual shaking for 1 min (i.e., ~25 μm emulsion droplets) and sonication for 30 s (~3 μm emulsion droplets), respectively, after 10-day storage. Right , TEM image of PVA micellar QDs. c Dialysis (against water) treatment on PS-PEG micellar QDs (left ) and PVA micellar QDs (right ), соответственно. A hand-held UV lamp was used to excite the red QD fluorescence

Further, we conducted two additional experiments to confirm the roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA. In the first experiment, we used a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF) instead of the water immiscible organic solvent chloroform. In this case, the “emulsion droplet” size could be considered as zero, and the surfactant PVA was not used because it was not needed to facilitate the mixing of oil phase with water phase. It was found that the fabrication process produced QD-encapsulated micelles with stable fluorescence (Fig. 4a), which is consistent with the result that small emulsion droplets lead to colloidally stable QD-encapsulated micelles and stable fluorescence. In addition, it was observed that the micelles formed by this process (with THF, without PVA) had large size distribution and some of the formed micelles even had non-spherical shapes (Fig. 4b). This indicates that “zero droplet size” could lead to poorly controlled micelle size and shape (although the formed micelles are colloidally stable). Thus, the results of the “zero emulsion droplet size” experiment (with the water-miscible THF as the organic solvent), on the one hand, are consistent with the finding that smaller emulsion droplets lead to colloidally stable micellar nanocrystals (judging by the stable fluorescence given by “zero-sized emulsion droplets”), and on the other hand, indicate the advantage of having an emulsion droplet (with non-zero droplet size) compared with no emulsion droplet at all (“zero-droplet size”, which gives poor micelle morphology). In the second experiment, we used electrospray, which is known to give ultrafine and uniform droplets with the typical droplet size range being a few hundred nanometers to a few micrometers (smaller than what the sonication treatment generates), as the method to produce emulsion droplets (PVA was used in this case) [35,36,37,38,39]. It was found that this method led to micellar QDs with stable fluorescence and well-controlled micelle size and shape (Fig. 4c, d). It should be mentioned that electrospray typically can only produce droplet sizes smaller than what the sonication treatment gives (i.e., a few hundred nanometers to a few micrometers). Thus, to study the effect of larger emulsion droplet size, in this work, we used another mechanical treatment method, i.e., manual shaking, to give larger droplets (~25 μm). The actual size of electrospray-generated droplets is difficult to be obtained by direct imaging (for example, the size of electrospray-generated oil-in-water emulsion droplets would change greatly upon entering the large volume of water phase in the collection container due to aggregation and fusion, and the typical sub-micrometer size of electrospray-generated droplets is approaching the diffraction limit of optical microscopy), but could be theoretically calculated or experimentally measured by methods that characterize aerodynamic mobility as done previously in the literature.

Using additional methods to form small emulsion droplets to confirm the importance of droplet size. а , b Using water-miscible THF as the oil phase solvent (without using PVA) led to micellar QDs with stable fluorescence (a ) and irregular micelle shapes (b ). c , d Using electrospray (with PVA) to form droplets led to micellar QDs with stable fluorescence (c ) and regular micelle shape (d )

Figure 5 presents a schematic to summarize our results and insights on the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystals-encapsulated micelles (with QDs as the model for nanocrystals). Each oil-in-water emulsion droplet serves as a “micro-reactor” for the interfacial instability-mediated self-assembly “reaction.” When no PVA (surfactant) is used, emulsion droplet does not form, and thus, no micelle is formed. When the emulsion droplet is large in size (~25 μm), only a part of the QDs (approximately 50%, based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, Fig. 2a) in the droplet get encapsulated in PS-PEG (an amphiphilic block copolymer) micelles, which are colloidally stable, while the other part of the QDs get encapsulated in PVA (also an amphiphilic polymer, but not a block copolymer) micelles, which are colloidally unstable. When the emulsion droplet is small in size (~3 μm or smaller), nearly all QDs (based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, combined with comparison of fluorescent intensity with hydrophobic QDs undergoing similar mechanical treatment, Fig. 2a, Fig. 4a, c, and Additional file 4:Fig. S4) in the droplet get encapsulated in stable PS-PEG micelles. Thus, the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystal-encapsulated micelles are intricate and intertwined, particularly in the context of biological applications:the surfactant PVA is required for successful formation of emulsion droplets and micelle products, and yet it is also responsible for formation of the colloidally unstable part of nanocrystal-encapsulated micelles, which would be detrimental in a number of biological applications; and the key to avoid the colloidally unstable nanocrystal-encapsulated PVA micelles is to use emulsion droplets small in size (~3 μm or smaller).

Roles of emulsion droplet size and surfactant in the interfacial instability-based fabrication of micellar nanocrystals

In addition, it should be mentioned that, for a well-dispersed oil-in-water emulsion to form, a surfactant is often required to lower the surface tension between the oil phase and water phase, and PVA was selected here as the surfactant because it was applied in nearly all the previous works on using the interfacial instability method to fabricate micelles [25, 26, 33,34,35]. We cannot rule out the possibility that other surfactants could give different results. Examining the effects of different types of surfactant would be part of the future studies.

Finally, we performed proof-of-concept biological experiments using live cells to demonstrate that our micellar nanocrystal products (with the emulsion droplets formed from sonication treatment for 30 s) are (1) fairly biocompatible, (2) can be functionalized with biological molecules, (3) can be introduced into live cells, and (4) if conjugated with biological targeting molecules, can bind with specific biological targets (Fig. 6). Cytotoxicity studies by MTT assay showed that the QD-encapsulated PS-PEG micelles had fairly low cytotoxicity in three different cell lines compared with the negative control (cultured cells in the absence of nanomaterials added, i.e., concentration being zero) (Fig. 6a). To bio-functionalize QD-encapsulated PS-PEG micelles, in the micelle fabrication process the PS-PEG molecules were replaced with PS-PEG-COOH molecules, the latter of which could then be conjugated with a wide spectrum of biomolecules (e.g., peptides, nucleic acids, and antibodies) via well-established bioconjugation methods. To show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be introduced into live cells, the micelles were conjugated with Tat peptide, which is derived from HIV virus and is known to be able to introduce a variety of nanomaterials into live cells with high efficiency and low toxicity [40,41,42]. The thus-formed Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs were then incubated with HeLa cells, and live cell confocal imaging was conducted to study the cellular transport of the fluorescent nanomaterials. The live cell confocal imaging system used here permits spinning-disk confocal imaging of live cells cultured on the microscope stage, ensuring that the natural transport process is followed with minimal disturbance. HeLa cells were selected here because this cell line was used in the first tracking study of the cellular transport of Tat peptide-conjugated QDs by Ruan et al. [42]. It was found that, 6 h after the first contact of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs with the cells, many of the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs had been internalized by the cells, judging by the composite confocal images to show the positions of QDs, cell nucleus and cell periphery, and the cellular uptake level was much higher than that without the assistance of Tat peptide (Fig. 6b). Imaging of the change of QD distribution at different time points of cellular transport for the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs indicated that, after entering the cells, they were gradually accumulated at a perinuclear region (Additional file 5:Fig. S5). Additional file 6:video 1 shows a three-dimensional reconstructured image of the distribution of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs in the cell at the time point of 24 h, which further confirms cellular internalization and perinuclear accumulation. The behavior of the cellular transport of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs is consistent with that of Tat peptide-conjugated QDs previously reported in the literature [42]. Further, to show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be modified (bio-functionalized) to bind with specific biological targets via ligand-receptor binding, the micelles were conjugated with RGD peptide, which is known to specifically recognize integrins on cell surface [43]. Fluorescent microscopy imaging results indicated that RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs could bind with α _v β₃ -integrin over-expressed cells (U87MG cell line, a human glioblastoma cell line, Fig. 6c, right), judging by the significant QD fluorescence on or in the cells. In contrast, the two control experiments, one of which used RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to incubate with MCF cells (without α _v β₃ -integrin over-expression, Fig. 6c, left) and the other of which used PS-PEG-COOH micellar QDs (without RGD peptide conjugation) to incubate with U87MG cells (Fig. 6c, middle), showed little to no QD fluorescence on or in the cells. Thus, these results demonstrated the ability of RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to specifically bind with α _v β₃ -integrin molecules.

Interactions of PS-PEG micellar QDs (prepared by using sonication 30 s in the interfacial instability method) with biological cells. а PS-PEG micellar QDs were fairly biocompatible judging from the MTT cytotoxicity assay results. The concentrations were based on the amounts of QDs used. б Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can be internalized by live cells. c RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can specifically recognize and bind with the α _v β₃ -integrin molecules over-expressed on U87MG cells (right image ). In comparison, in the absence of α _v β₃ -integrin over-expression (MCF-7 cells, left image ) or Tat peptide (PS-PEG-COOH micellar QDs, middle image ), no significant binding (QD fluorescence) was observed. The red fluorescence was from QDs. The cell nucleus was stained by the blue fluorescent dye Hoechst 33342. Cell periphery is shown by white line (from the corresponding bright field microscopy images)

Выводы

In conclusion, we have used QDs as the model nanocrystals to follow the interfacial instability process, an emerging general method to fabricate nanocrystal-encapsulated micelles. Our results reveal the key roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA in the interfacial instability process. These results not only help to optimize the quality of nanocrystal-encapsulated micelles for biological applications such as biological detection, imaging and therapy, but offer helpful new knowledge on the interfacial instability process in particular and self-assembly in general.

Сокращения

EDC:

1-Ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

PS-PEG:

Poly (styrene-b-ethylene glycol)

PS-PEG-COOH:

Carboxylic acid terminated poly (styrene-b-ethylene glycol)

PTA:

Phosphotungstic acid

PVA:

Poly (vinyl alcohol)

QD:

Quantum dot

SPION:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticle

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

THF:

Tetrahydrofuran