Ферумокситол снижает активность MDSC для облегчения ЛПС-индуцированного иммунодефицита при сепсе

Аннотация

Иммунодефицит, индуцируемый сепсисом, признан одной из главных причин терапевтических неудач. Миелоидные супрессорные клетки (MDSC), характеризующиеся их супрессивными свойствами, сообщалось, расширяются при сепсе. Ферумокситол (ФМТ), одобренный FDA препарат железа, демонстрировал иммуномодуляторные свойства в опухолях. Однако неясно, меняет ли ФМТ функции MDSC для уменьшения иммунодефицита поздней стадии сепсиса. Здесь мы показали иммуномодуляторный эффект ФМТ на MDSC для улучшения иммунодефицита, индуцируемого липополисахаридом (ЛПС) на поздней стадии сепсиса. Разделение клеток с интернализированным ФМТ и определение внутриклеточного содержания железа показали, что MDSC способны поглощать ФМТ. Низкие дозы ФМТ не влияли на живучесть MDSC, но ФМТ ингибировал экспансию MDSC in vitro. Более того, ФМТ значимо снизил уровни экспрессии Arg-1, S100A8, S100A9 и p47phox, а также продукцию РАК в MDSC. ФМТ уменьшил процент гранулоцитарных MDSC (G-MDSC) и стимулировал дифференцировку MDSC в макрофаги. Кроме того, ФМТ снизил рекрутирование лейкоцитов и утолщение альвеолярных стенок в лёгких и зоны некроза в печени, а также некоторые биохимические маркеры печеночной дисфункции. ФМТ уменьшил процент G-MDSC и моноцитарных MDSC (M-MDSC) в селезёнках ЛПС-индуцированных септичных мышей. Важно, ФМТ снизил иммуносупрессивные функции T-клеток как G-MDSC, так и M-MDSC. Ожидаемо, ФМТ также значимо снизил геновую экспрессию Arg-1 и p47phox в спленических CD11b⁺Gr-1⁺ клетках, изолированных от ЛПС-стимулированных мышей. Эти данные указывают на то, что ФМТ снижает иммуносупрессивные функции MDSC за счёт уменьшения продукции Arg-1 и РАК, предполагая, что ФМТ может уменьшить долгосрочный иммунодефицит на поздней стадии сепсиса.

Введение

ФМТ, добавка железа, одобренная Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств, использовалась для лечения железодефицитной анемии у взрослых с хронической болезнью почек, и также широко применяется как контрастное вещество и носитель лекарств. Предыдущие исследования показали, что ФМТ обладает иммуномодуляторными свойствами, такими как способность индуцировать фенотипический сдвиг M2 макрофагов к подтипу M1 с высокой экспрессией CD86⁺, TNF-α положительным. Однако эффекты ФМТ на другие иммунные клетки не изучались.

MDSC — гетерогенная популяция незрелых миелоидных клеток с мощной иммуносупрессивной способностью. У мышей MDSC идентифицируются как Gr-1⁺CD11b⁺ клетки, в то время как человеческие MDSC лишены гомолога Gr-1 и определяются как CD14⁻HLA-DR⁻CD11b⁺CD33⁺ или CD14⁺HLA-DR⁻CD11b⁺CD33⁺ клетки. MDSC состоят из двух больших групп: гранулоцитарных (PMN-MDSC) и моноцитарных (M-MDSC), и обе популяции обладают иммуносупрессивными функциями через продукцию iNOS, РАК и Arg-1. Повышенная активность Arg-1 истощает L-аргинин, и дефицит L-аргинина ингибирует пролиферацию T-клеток за счёт снижения экспрессии CD3 дзета-цепи. iNOS генерирует NO, ингибирующий функции JAK3 и STAT5 в T-клетках, а также экспрессию MHC II. РАК индуцируют посттрансляционную модификацию T-клеточных рецепторов и могут вызывать нереагирование антиген-специфических T-клеток. M-MDSC возникают из моноцитарных предшественников и могут дифференцироваться в макрофаги и ДК под действием соответствующих цитокинов. Большинство знаний о MDSC получено из онкологических исследований. В последние годы экспансия MDSC также описывалась в острых и хронических воспалительных заболеваниях, включая воспаление, ожоги и аутоиммунные заболевания. Недавно в визуализационных исследованиях сообщалось о высоком уровне поглощения флуоресцентных наночастиц MDSC в пищеводе и селезёнке мышей. Однако неясно, меняет ли ФМТ функцию MDSC, вовлечённую в развитие воспалительных заболеваний.

Сепсис — дисрегулированная воспалительная реакция хозяина на тяжёлую инфекцию, вызывающая опасную для жизни органную дисфункцию, — самая частая причина смерти в реанимации. Сепсис инициирует излишнюю провоспалительную реакцию, которая, если не лечится рано, быстро трансформируется в долгосрочный иммунодефицит. Экспансия MDSC описана в селезёнках и лимфатических узлах в моделях сепсиса на животных, а также у пациентов с сепсисом. Активация иммуносупрессивных клеток, таких как MDSC, критична для адекватного контроля гиперреактивности врождённой иммунной системы, но их избыточная экспансия может привести к гипериммунодефициту, который является доминирующей движущей силой вторичной инфекции и смертности на поздней стадии сепсиса. Увеличение числа MDSC коррелирует с подавлением пролиферации лимфоцитов. Сообщалось, что MDSC приобретают свой фенотип в костном мозге, а затем мигрируют в вторичные лимфоидные органы для ингибирования T-клеточных реакций и подавления их пролиферации у ЛПС-иммунодефицитных мышей. Большинство пациентов с затяжным сепсисом демонстрируют иммуносупрессивный статус, и большая часть смертности от сепсиса обусловлена иммунодефицитом поздней стадии. Элиминация MDSC может иметь благоприятные эффекты на поздней стадии сепсиса за счёт восстановления иммунного ответа. Поэтому мы предположили, что ФМТ может модулировать функции MDSC для уменьшения иммунодефицита поздней стадии сепсиса.

Здесь мы показали иммуномодуляторный эффект ФМТ на MDSC. Мы использовали магнитные свойства ФМТ, чтобы раскрыть, что MDSC способны фагоцитировать ФМТ in vitro. Более того, мы обнаружили, что ФМТ аттенюирует иммуносупрессивную функцию MDSC через регуляцию вниз Arg-1 и РАК. Дополнительно, in vivo эксперименты подтвердили, что ФМТ улучшает позднюю стадию ЛПС-индуцированного сепсиса у мышей, ослабляя способность MDSC ингибировать T-клетки. Наши данные предполагают, что иммуномодуляторная функция ФМТ может быть использована для лечения иммунодефицита, возникающего на поздней стадии сепсиса.

Материалы и методы

Мыши

Самцы линии C57BL/6 (8–10 недель) приобретены в Центре модельных животных Нанкинского университета (Нанкин, Китай). Мыши содержали в специфически патоген-свободных (SPF) условиях на 24-часовом цикле свет/тьма с свободным доступом к еде и воде. Все эксперименты с мышами одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Нанкинского университета.

Прусское синее окрашивание

Внутриклеточное распределение ФМТ детектировалось с использованием набора для прусского синего окрашивания Перля (Solarbio, Китай) согласно инструкции производителя. Кратко, клетки фиксировали в 4% параформальдегиде 15 мин, затем инкубировали с 10% ферроцианидом калия 25–30 мин, с последующим промыванием и контрастным окрашиванием ядерным быстрым красным 10 мин. Клетки с синими гранулами в цитоплазме считались положительными по прусскому синему.

Генерация MDSC из костного мозга

Клетки костного мозга получали промыванием бедренных и голенёвичных костей диких мышей с последующим лизисом эритроцитов. Клетки костного мозга культивировали в полном среде RPMI-1640 с 10% ФБС, 1% пенициллина/стрептомицина, 40 нг/мл GM-CSF и 40 нг/мл IL-6 при 37 °C в инкубаторе с 5% CO₂ в течение 4 дней. Неадгезивные клетки собирали для дальнейших экспериментов.

Анализ живучести клеток

Живучесть клеток анализировалась с использованием набора Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Кумамото, Япония) согласно инструкции. Кратко, MDSC (5 × 10³) посеяли в 96-колончатые пластинки и инкубировали в атмосфере 5% CO₂ при 37 °C перед обработкой. Среду затем заменяли на свежую с различными концентрациями ФМТ (250, 500, 1000, 2000 мкг/мл) на 24 ч. Супернатант удаляли и добавляли свежую среду с раствором CCK-8. После инкубации при 37 °C 3 ч абсорбция измерялась при 450 нм на микропластинчатом считывателе Gen5 (BioTek, США).

Изоляция полной РНК и PCR в реальном времени

Полная РНК извлекалась из клеток реактивом TRIzol (Invitrogen, США) и kvantificировалась на спектрофотометре Nanodrop (Thermo Scientific, США) перед обратной транскрипцией с использованием набора HiScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd, Китай) согласно инструкции. Количественный PCR в реальном времени выполнялся с использованием набора SYBR Green PCR Kit (Bio-Rad, Геркулес, CA) на системе Applied Biosystems StepOne-Plus (Applied Biosystems, Форстер-Сити, CA). Геновая экспрессия нормировалась на GAPDH методом 2^−ΔΔCt. Последовательности праймеров приведены в Дополнительном файле 1: Таблица S1.

Проточная цитометрия

Ткани подготавливали как одиночные клеточные суспензии с коллагеназой типа D (1 мг/мл) и ДНКазой I (0.1 мг/мл) в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) при 37 °C 30 мин, затем эритроциты селезёнки лизировали. Клеточные суспензии фильтровали через 70-мкм фильтры, лимфоциты собирали центрифугированием 300 g 5 мин при 4 °C. После промывания клетки сразу готовили для флуоресцентно-активированной клетковой сортировки. Одиночные клетки инкубировали с реагентом блокировки FcR (Miltenyi Biotech, Германия) 10 мин, затем окрашивали следующими антителами-конъюгатами 20 мин: FITC-маркированные anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD4, anti-CD8; PE-маркированные anti-Ly6G; APC-маркированные anti-Ly6C, anti-CD3, anti-F4/80, anti-MHC II (BioLegend, CA). После промывания клетки детектировали на FACS Calibur (BD, CA), данные анализировали в FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., США).

Г&Е окрашивание

Ткани печени и лёгких фиксировали в 4% фосфатно-буферизованном формальдегиде. Фиксированную ткань парафинизировали, делали 5-мкм срезы и окрашивали гемоксилином и эозином для световой микроскопии.

Иммуноферментный анализ (ELISA)

Уровни TNFα, MCP-1 и IL-1β в сыворотке определяли с использованием специфических ELISA-наборов (Dakewe, Китай) согласно инструкции. Каждый образец прогоняли в дубликате.

Детекция РАК

Внутриклеточные РАК измеряли с использованием набора 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) (Beyotime, Китай) согласно инструкции. Кратко, клетки промывали дважды ПБС и инкубировали с 5 мкМ DCFH-DA при 37 °C в темноте 30 мин, затем промывали средой RPMI-1640 и ресуспендировали в ПБС. Клетки анализировали на внутриклеточную зелёную флуоресценцию проточной цитометрией (BD, CA).

Анализ пролиферации T-клеток

Всего CD3⁺ T-клетки обогащали из селезёнок диких мышей с использованием набора CD3ε MicroBead (Miltenyi Biotech, Германия) и инкубировали с красителем CFSE (Invitrogen, USA). Для анти-CD3/CD28 антитела-индуцированной пролиферации T-клетки активировали анти-CD3 антителом (1 мкг/мл) и анти-CD28 антителом (1 мкг/мл). G-MDSC (Gr-1^highLy-6G⁺) и M-MDSC (Gr-1^dimLy-6G⁻) изолировали из селезёнок мышей, получивших ФМТ или транспортёр, с использованием набора для изоляции миелоидных супрессорных клеток (Miltenyi Biotech, Германия) согласно инструкции. MDSC ко-культивировали в соотношении 1:1 с CFSE-маркированными CD3⁺ T-клетками в 96-колончастых плоских пластинках 3 дня. CFSE равномерно распределяется между дочерними клетками при каждом делении; поэтому пролиферация определялась проточной цитометрией. Чистота клеток после сортировки была > 90%.

Статистика и анализ данных

Вся статистика рассчитывалась с использованием GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, CA) и представлялась как среднее ± стандартное отклонение (SD). Различия между двумя группами анализировали тестом Манна-Уитни или непарным двусторонним t-критерием Стьюдента. Односторонний ANOVA использовался для сравнения нескольких групп. Все эксперименты повторяли минимум три раза. Различия со значениями p < 0.05 считались статистически значимыми.

Результаты

Большое количество MDSC поглощают ФМТ

Для проверки того, что клетки с интернализированным ФМТ разделяются MACS MicroBeads, мы использовали прусское синее окрашивание для детекции внутриклеточного железа в макрофагах, обработанных ФМТ (1000 нг/мл) 24 ч. Клетки делили на три группы: до магнитного разделения, магнитно отобранные ФМТ-позитивные (ФМТ+), и не магнитно изолированные (ФМТ-). Прусское синее окрашивание продемонстрировало, что большинство магнитно отобранных клеток были положительными по прусскому синему (рис. 1a). Для сравнения способности фагоцитировать ФМТ между MDSC, макрофагами и ДК, мы изолировали спленоциты от наивных мышей C57BL/6, обработанных ФМТ 6, 12, 24 и 48 ч. Спленоциты делили на два подмножества: до магнитного разделения и ФМТ-позитивные клетки. Проточная цитометрия раскрыла, что почти 60% MDSC и более 60% макрофагов накапливали ФМТ после 12–48 ч (рис. 1b, c). Только примерно 40% ДК были ФМТ-позитивными к 24 ч. Эти данные показали, что, как макрофаги, MDSC могут поглощать ФМТ и предполагали, что ФМТ может влиять на функцию MDSC.

Способности MDSC, макрофагов и ДК поглощать ФМТ. a Макрофаги обрабатывали ФМТ (1000 нг/мл) 24 ч, затем окрашивали прусским синим для определения клеточного присутствия и депонирования железа среди трёх групп: до магнитного разделения, магнитно отобранные (ФМТ+), не магнитно изолированные (ФМТ-). b Спленоциты наивных мышей C57BL/6 инкубировали с ФМТ 6, 12, 24, 48 ч. FACS-анализ процентов MDSC, макрофагов и ДК в двух подмножествах: до магнитного разделения, ФМТ-позитивные клетки. c Соотношение ФМТ-позитивных клеток к клеткам до магнитного разделения. Все данные представлены тремя независимыми экспериментами для каждой экспериментальной группы и отображены как среднее ± стандартное отклонение.

ФМТ ингибирует экспансию MDSC in vitro

Сообщалось, что ФМТ индуцирует фенотипический сдвиг M2 макрофагов к подтипу M1 с высокой экспрессией CD86⁺, TNF-α положительным. Поскольку большое количество MDSC может поглощать ФМТ, мы гипотезировали, что ФМТ может менять функцию MDSC. Сначала цитотоксические эффекты ФМТ при 250, 500, 1000 и 2000 мкг/мл на MDSC оценивали анализом живучести CCK8. Результаты показали, что ФМТ не влиял на живучесть при низких дозах и демонстрировал только умеренную цитотоксичность при максимальной дозе 2000 мкг/мл (рис. 2a). Затем мы тестировали, влияет ли ФМТ при разных концентрациях на генерацию MDSC. Клетки костного мозга, изолированные от наивных мышей C57BL/6, обрабатывали средой или различными концентрациями ФМТ (250, 500, 1000, 2000 мкг/мл) 4 дня, с последующей характеристикой проточной цитометрией на 4-й день. GM-CSF и IL-6 добавляли на 0-й день. Результаты трёх независимых экспериментов раскрыли, что ФМТ при 1000 и 2000 мкг/мл значимо снижал экспансию MDSC (рис. 2b, c).

Проточная цитометрическая квантификация процента CD11b⁺Gr-1⁺ клеток после обработки ФМТ при 250, 500, 1000, 2000 мкг/мл in vitro. a Живучесть MDSC детектировалась CCK8 после обработки различными концентрациями ФМТ 24 ч. b, c Клетки костного мозга от мышей C57BL/6 культивировали 4 дня с GM-CSF и IL-6 в присутствии разных концентраций ФМТ, фенотипы клеток оценивали проточной цитометрией. Все данные представлены тремя независимыми экспериментами для каждой экспериментальной группы и отображены как среднее ± стандартное отклонение. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 по непарному t-тесту Стьюдента относительно клеток, обработанных только транспортёром.

ФМТ снижает иммуносупрессивную способность MDSC

MDSC используют несколько механизмов для ингибирования пролиферации и эффекторной функции T-клеток, наиболее описанными из которых являются продукция РАК и Arg-1. Экспрессия компонента p47phox комплекса никотинамидадинуклеотидфосфата-оксидазы (NOX) отвечает за продукцию РАК в MDSC. Сообщалось, что S100A8/A9 синтезируется и секретируется MDSC в аутоиндуцируемом воспалительном цикле и что это важно для подавления функции дендритных клеток в моделях на мышах. Чтобы определить, может ли ФМТ менять функцию MDSC, мы получали MDSC из костного мозга как описано выше и использовали RT-PCR для измерения мРНК экспрессии в ФМТ-обработанных MDSC против необработанных контрольных. Результаты раскрыли, что ФМТ-обработанные MDSC значимо снизили уровни экспрессии Arg-1, S100A8, S100A9 и p47phox по сравнению с необработанными MDSC (рис. 3a–h). Далее мы оценили уровни РАК в контрольных MDSC и ФМТ-обработанных MDSC. Результаты показали, что ФМТ-обработанные MDSC демонстрировали значимо более низкий уровень РАК, чем контрольные клетки (рис. 3i, j). Мы также сравнили изменения в подпопуляциях MDSC в ФМТ-обработанных и контрольных группах. Результаты показали, что ФМТ уменьшил процент G-MDSC, с лёгким увеличением M-MDSC также наблюдаемым (рис. 3k, l).

ФМТ меняет функцию MDSC in vitro. MDSC из костного мозга, обработанные транспортёром или ФМТ 24 ч. a–h Геновая экспрессия Arg-1, S100A8, S100A9 и p47phox из обработанных MDSC, измеренная количественным RT-PCR. i MDSC из костного мозга инкубировали с ФМТ 24 ч, продукция РАК детектировалась FCM. j Количественные данные i. k Подпопуляции MDSC в ФМТ-обработанных и контрольных группах. l FACS-анализ процентов G-MDSC и M-MDSC. Все данные представлены тремя независимыми экспериментами для каждой экспериментальной группы и отображены как среднее ± стандартное отклонение. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 по непарному t-тесту Стьюдента относительно клеток, обработанных только транспортёром.

ФМТ стимулирует дифференцировку MDSC в макрофаги

Чтобы определить, стимулирует ли ФМТ терминальную дифференцировку MDSC в макрофаги, мы обрабатывали клетки 1000 мкг/мл ФМТ на 0-й день и выполняли проточную цитометрию для макрофажных маркеров CD11b и F4/80 на 1, 3 и 5 дни. Результаты показали, что за 1 день после добавления 1000 мкг/мл ФМТ пропорция макрофагов значимо увеличилась более чем в 2 раза по сравнению с необработанными клетками. Аналогично, через 3 и 5 дней после обработки ФМТ пропорции макрофагов также значимо увеличивались (рис. 4a, b).

Эффект ФМТ на дифференцировку MDSC. a, b MDSC из костного мозга обрабатывали с или без 1000 мкг/мл ФМТ, число макрофагов оценивали через 1, 3 и 5 дней FACS. Все данные представлены тремя независимыми экспериментами для каждой экспериментальной группы и отображены как среднее ± стандартное отклонение. *p < 0.05 относительно клеток, обработанных только транспортёром.

ФМТ улучшает симптомы у ЛПС-индуцированных септичных мышей

Сообщалось, что сепсис ассоциируется с тканевым повреждением и ведёт к органной недостаточности и эндотелиальной дисфункции. Чтобы изучить, снижает ли ФМТ симптомы поздней стадии сепсиса, степень органного повреждения в экспериментальных мышах оценивали через 10 дней. Гистопатологическое обследование лёгких при ЛПС-индуцированном сепсисе указало, что ФМТ снизил рекрутирование лейкоцитов и утолщение альвеолярных стенок по сравнению с транспортёром-обработанными мышами. Г&Е окрашивание также раскрыло, что площадь печеночного некроза была меньше у ФМТ-обработанных мышей по сравнению с контрольными (рис. 5a, b). Более того, уровни аспартат-аминотрансферазы в сыворотке, используемые как биохимический маркер печеночной дисфункции, были значимо ниже в печени ФМТ-обработанных мышей по сравнению с контролем (рис. 5c). Однако ФМТ не влиял на уровны аланин-аминотрансферазы (рис. 5d). Кроме того, сепсис считается ассоциированным с неблагоприятными исходами, такими как повышенная продукция провоспалительных цитокинов; поэтому мы оценивали изменения уровней провоспалительных цитокинов в сыворотке. Уровень TNF-α в сыворотке был слегка, но незначимо ниже у ФМТ-обработанных мышей через 3 ч после ЛПС-инъекции, и различий в уровнях MCP-1 или IL-1β между ФМТ-обработанными и транспортёром-обработанными мышами не наблюдалось (рис. 5e–g).

ФМТ улучшает печеночное повреждение у ЛПС-индуцированных септичных мышей. a Мыши получали либо ПБС, либо в/б инъекцию 5 мг/кг бактериального ЛПС в 0-й день. Через 1 ч и 5 дней ФМТ в дозе 10 мг/кг или 100 мкл физраствора вводили в хвостовую вену. Мыши делили на четыре группы (n = 6): контроль, получающий транспортёр; ЛПС, получающий только ЛПС; ФМТ, получающий только ФМТ; и ЛПС + ФМТ, получающий ЛПС и ФМТ. b Ткани лёгких и печени окрашивали гемоксилином и эозином. c-d Сывороточные трансаминазы (ALT и AST) измеряли (n = 6). Уровни цитокинов (TNF-α, IL-1β, MCP-1) измеряли ELISA. e-g Эффекты ЛПС-индуцированного сепсиса на цитокиновую продукцию у транспортёром- или ферумокситол-обработанных мышей. Уровни цитокинов измеряли ELISA в сыворотке транспортёром- или ферумокситол-обработанных мышей после в/б ЛПС-челленджа (50 мг/кг). **p < 0.01 по непарному t-тесту Стьюдента.

ФМТ уменьшает число MDSC в селезёнке ЛПС-индуцированных септичных мышей

Накопляющиеся доказательства подтверждают, что сепсис-ассоциированный иммунодефицит повышает смертность, и MDSC считаются основным компонентом иммуносупрессивной сети. Сообщалось, что G-MDSC более специфически экспандируют у септических пациентов и кажутся главными актёрами сепсис-индуцированного иммунодефицита. Чтобы определить, модулирует ли ФМТ популяции MDSC у диких мышей, мышам C57BL/6 вводили ФМТ в хвостовую вену на 1-й час и 5-й день. Результаты показали, что значимых различий в проценте MDSC в селезёнке или костном мозге между контролем и ФМТ-обработанными мышами не обнаруживалось (рис. 6a, e). Важно, ФМТ снизил ЛПС-зависимую экспансию CD11b⁺Gr-1⁺ клеток как в костном мозге, так и в селезёнке (рис. 6a, e), что согласуется с in vitro исследованиями. Более того, ФМТ также уменьшил процент G-MDSC и M-MDSC в селезёнке, тогда как только процент G-MDSC уменьшался в костном мозге (рис. 6c, g). Эти данные указывают на то, что ФМТ уменьшает число MDSC в селезёнке ЛПС-индуцированных септичных мышей.

ФМТ уменьшает число MDSC у ЛПС-индуцированных септичных мышей. Мыши делили на четыре группы (n = 6): контроль, получающий транспортёр; ЛПС, получающий только ЛПС; ФМТ, получающий только ФМТ; и ЛПС + ФМТ, получающий ЛПС и ФМТ. a Популяции CD11b⁺Gr-1⁺ в костном мозге детектировались FACS. b Количественные данные a. c Точечный график проточной цитометрии экспрессии Ly6C и Ly6G в отобранных CD11b⁺ клетках из селезёнки. d Квантификация процентов гранулоцитарных и моноцитарных подмножеств. e Популяции CD11b⁺Gr-1⁺ в селезёнке детектировались FCM. f Количественные данные e. g Точечный график проточной цитометрии экспрессии Ly6C и Ly6G в отобранных CD11b⁺ клетках из селезёнки. h Квантификация процентов гранулоцитарных и моноцитарных подмножеств. *p < 0.05 по непарному t-тесту Стьюдента.

ФМТ снижает иммуносупрессивные свойства MDSC по отношению к T-клеткам in vivo

Численное сокращение множества иммунных клеточных популяций, включая CD4 и CD8 T-клетки, является главной характеристикой адаптивного иммунного ответа после сепсиса. Это ассоциировано с повышенным риском смерти и другими неблагоприятными исходами. Показано, что MDSC подавляют пролиферацию T-клеток, ухудшая экспрессию дзета-цепи T-клеток у пациентов с сепсисом. Чтобы оценить пропорцию лимфоцитов на поздней стадии сепсиса, мы измеряли пропорцию CD4 и CD8 T-клеток в муриновой модели сепсиса. Результаты показали, что ФМТ вызвал увеличение CD4 и CD8 T-клеток в селезёнках ЛПС-индуцированных мышей (рис. 7a, b). Различий в процентах CD4 и CD8 T-клеток в селезёнке ФМТ-обработанных мышей по сравнению с контрольными не было (рис. 7a, b). Для дополнительного подтверждения роли MDSC в подавлении пролиферации T-клеток in vivo, G-MDSC и M-MDSC изолировали из селезёнок транспортёром- или ФМТ-обработанных ЛПС-челлендж-мышей по MACS и ко-культивировали с CD3 T-клетками в соотношении 1:1. Наши результаты показали, что обработка ФМТ снизила иммуносупрессивные функции T-клеток как G-MDSC, так и M-MDSC (рис. 7e, f). Кроме того, мы также измеряли уровни экспрессии Arg-1 и p47phox в MDSC, изолированных из селезёнок мышей. Как ожидалось, геновая экспрессия Arg-1 и p47phox была значимо снижена в спленических CD11b⁺Gr-1⁺ клетках, изолированных от ФМТ-обработанных ЛПС-челлендж-мышей по сравнению с ЛПС-челлендж-мышами (рис. 7g, h). Эти данные указывают на то, что ФМТ снизил иммуносупрессивные функции MDSC за счёт уменьшения продукции Arg-1 и РАК, предполагая, что ФМТ может уменьшить долгосрочный иммунодефицит на поздней стадии сепсиса.

ФМТ снижает иммуносупрессивные свойства MDSC. a Популяции CD3⁺CD4⁺ в селезёнке детектировались FACS. b Количественные данные a. c Популяции CD3⁺CD8⁺ в селезёнке детектировались FACS. d Количественные данные a. e Способность G-MDSC от мышей подавлять пролиферацию T-клеток, индуцированную анти-CD3/CD28 стимуляцией, измерялась FACS (n = 3 на группу). Показан представительный гистограмма. f Способность M-MDSC от транспортёром- или ФМТ-обработанных ЛПС-челлендж-мышей подавлять пролиферацию T-клеток, индуцированную анти-CD3/CD28 стимуляцией, измерялась FACS (n = 3 на группу). Показан представительный гистограмма. g, h мРНК экспрессия Arg-1 и p47phox в MDSC от транспортёром- или ФМТ-обработанных ЛПС-челлендж-мышей.

Обсуждение

Одобренный FDA добавка железа ФМТ широко использовалась как носитель лекарств и контрастное вещество в МРТ. Было найдено, что ФМТ ингибирует рост рака индуцируя провоспалительный иммунный ответ с поляризацией M1 макрофагов, указывая на иммуномодуляторные функции ФМТ. В этом исследовании мы оценили эффект ФМТ на MDSC, сравнивая фенотип и функцию ФМТ-обработанных MDSC с контрольными необработанными MDSC. Предыдущие исследования показали, что MDSC способны поглощать магнитные наночастицы, и наши данные дополнительно продемонстрировали, что ФМТ аттенюирует иммуносупрессивные функции MDSC в селезёнке через регуляцию вниз Arg-1 и РАК. Наши данные также указали, что ФМТ имеет прямой эффект на дифференцировку MDSC, с приблизительно пятой частью клеток, дифференцирующихся равномерно в макрофаги через 5 дней в in vitro экспериментах. Хотя мы не изучали фенотип макрофагов, экспонированных ФМТ, мы гипотезировали, что они были провоспалительным M1 подтипом. Результаты чётко продемонстрировали, что ФМТ улучшает дифференцировку и созревание MDSC, и таким образом предполагает, что это подлежит снижению популяции MDSC, которое мы наблюдали во время поздней стадии сепсиса.

Сепсис инициирует сложный иммунный ответ, меняющийся во времени и сопровождаемый как провоспалительными, так и антивоспалительными реакциями. Предыдущие исследования показали, что смерть на ранних стадиях сепсиса обусловлена избыточным воспалением. Derive и соавт. сообщали, что адоптивный перенос 10-дневных MDSC в септичных мышей аттенюировал цитокиновую продукцию в брюшной полости и улучшал выживаемость. Недавно Namkoog и соавт. наблюдали, что претретмент кларитромицином улучшал выживаемость в модели ЛПС-индуцированного шока мышей за счёт экспансии CD11b⁺Gr-1⁺ популяции. Они описали, что MDSC играют защитную роль при сепсисе, однако следует отметить, что они касались ранних стадий сепсиса. Большинство пациентов с сепсисом демонстрируют быстрые признаки глубокого иммунодефицита, и смерти в этой фазе типично обусловлены приобретением вторичной ноzoekомиальной инфекции, часто с оппортунистическими патогенами. Излишняя пролиферация MDSC может способствовать физиологическому синдрому постоянного иммунодефицита, вызывая плохие исходы. McClure и соавт. сообщали, что не наблюдали защитных эффектов от переноса MDSC, когда мыши входили в поздний иммуносупрессивное состояние. Они ранее показывали, что MDSC массово экспандируют в костном мозге, селезёнке и лимфатических узлах мышей с текущими септическими процессами и способствуют сепсис-индуцированному T-клеточному подавлению. Дополнительно, Uhel сообщил, что M-MDSC и G-MDSC сильно способствуют T-клеточной дисфункции у пациентов с сепсисом. Наши данные продемонстрировали, что ФМТ значимо снизил процент MDSC и аттенюировал функции MDSC для восстановления числа T-клеток у мышей во время поздней стадии сепсиса. Поэтому, изучая роль MDSC в сепсисе, критично чётко различать ранние и поздние стадии сепсиса.

Mohus и соавт. предполагали, что железодефицит ассоциирован с повышенным риском будущих бактериемий, вызывающих сепсис, указывая на то, что механизмы иммунной защиты могут быть подавлены по сравнению с бактериальным секвестрением железа в низкожилезных средах. Споры, показанные в исследованиях железосодержащих добавок, сообщали, что внутривенная железотерапия ассоциировалась с повышенным риском инфекции. Следует отметить, что железосодержащие добавки значительно отличаются в своих физико-химических свойствах, что даёт им разные биологические свойства. С ФМТ, железное ядро обёрнуто углеводной оболочкой, что приводит к низкой токсичности, лизосомальному поглощению и деградации. Сообщалось, что ФМТ не вызывает гепатотоксичности у пациентов или животных моделей и типично метаболизируется в течение 2 месяцев. Наши данные показали, что ФМТ не увеличивает продукцию провоспалительных цитокинов на ранней стадии сепсиса, указывая на то, что ФМТ может вводиться при сепсисе.

Заключение

Это исследование продемонстрировало новое иммуномодуляторное свойство ФМТ; однако дальнейшие исследования необходимы для эллицидирования механизма подавления MDSC ФМТ. Более того, мы предоставляем привлекательный терапевтический подход для лечения сепсис-ассоциированного иммунодефицита, и таргетирование MDSC может дать перспективный новый вариант для восстановления иммунного ответа во время сепсиса.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, использованные и/или проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Аббревиатуры

ALT:

Аланин-аминотрансфераза

Arg1:

Аргиназа 1

AST:

Аспартат-аминотрансфераза

ФМТ:

Ферумокситол

G-MDSC/PMN-MDSC:

Полиморфнуклеарные MDSC/гранулоцитарные MDSC

Г&Е:

Гемоксилин-эозин

IL-1β:

Интерлейкин-1β

iNOS:

Индуцируемая оксид азота синтаза

ЛПС:

Липополисахарид

MCP-1:

Моноцитарный хемоаттрактантный белок 1

MDSC:

Миелоидные супрессорные клетки

MHC II:

Комплекс главной гистосовместимости

M-MDSC:

Моноцитарные MDSC

ПБС:

Фосфатно-буферизованный раствор

РАК:

Реактивные формы кислорода

TLR:

Толл-подобный рецептор

TNF-α:

Туморальный некрозный фактор α