Оптическая микроскопия

Оптическая микроскопия  

Микроскопия изучает увеличение изображения объектов, которые слишком малы, чтобы их можно было правильно увидеть невооруженным глазом. Микроскопия выполняет свою задачу, используя излучения (рис. 1), испускаемые, поглощаемые, пропускаемые или отражаемые исследуемым образцом. Характер излучения определяет тип микроскопии, такой как оптическая микроскопия, электронная микроскопия, рентгеновская микроскопия, акустическая микроскопия и т. д. Видимая часть электромагнитного спектра — это тип излучения, используемого в оптической микроскопии. Оптическая микроскопия — это микроскопическое исследование материалов с помощью оптического микроскопа.

Рис. 1. Электромагнитные волны

Грубые увеличительные стекла использовались в древние времена, но эволюция современных микроскопов началась в 17 веке. Хотя первый составной микроскоп был построен Гансом и Захариасом Янссенами в 1595 году, Антони ван Левенгук (1632–1723) сумел сделать линзы настолько хорошими, что в их очень простых микроскопах удалось добиться поразительного увеличения примерно в 300 раз. По предложению ученого Роберта Хука около 1670 года мастер инструментов Кристофер Кок в Лондоне построил очень удачный составной микроскоп. С помощью этого прибора Крюк смог наблюдать за клетками. Микроскоп Гука можно считать отцом современных инструментов.

Оптический микроскоп, часто называемый «световым микроскопом», представляет собой тип микроскопа, в котором используется видимый свет (рис. 1) и система линз для увеличения изображений небольших образцов. Оптические микроскопы — самые старые и простые из микроскопов. Это очень важный инструмент для изучения микроструктуры, несмотря на эволюцию сложных электронных металлографических инструментов. Бесценными инструментами также являются сложные «сканирующий электронный микроскоп» (СЭМ) и «просвечивающий электронный микроскоп» (ПЭМ). Однако их следует использовать вместе с оптическим микроскопом, а не вместо него.

Все исследования микроструктуры начинаются с использования оптического микроскопа, начиная с малого увеличения, например, 100-кратного, за которым следует постепенно увеличивающееся увеличение для эффективной оценки основных характеристик микроструктуры. Большинство микроструктур можно наблюдать с помощью оптического микроскопа и идентифицировать по их характеристикам. Идентификации сомнительных или неизвестных компонентов может помочь наблюдение за их твердостью по отношению к матрице, по их естественному цвету, по их реакции на поляризованный свет и по их реакции на селективные травители. Эти наблюдения сравниваются с известными подробностями о физической металлургии исследуемого материала. Если сомнения все еще остаются или если структура слишком тонкая, чтобы ее можно было наблюдать, следует применить более сложные методы.

Оптический микроскоп можно использовать для исследования отполированных или протравленных металлографических образцов. Некоторые компоненты легче увидеть в отполированном виде, потому что они не затемняются деталями травления. Включения, нитриды, некоторые карбиды и интерметаллические фазы можно легко наблюдать без травления. Остальные фазы, за исключением включений, можно легче исследовать, если при окончательной полировке внести некоторый рельеф. Образцы должны быть надлежащим образом подготовлены, чтобы обеспечить правильное наблюдение и интерпретацию микроструктуры без осложнений, связанных с артефактами. Образцы, которые реагируют на поляризованный свет, такие как материалы с некубической кристаллической структурой, обычно исследуют без травления. Однако в большинстве случаев для наблюдения за микроструктурой необходимо проводить травление. Травитель общего назначения обычно используется в первую очередь для выявления зернистой структуры и присутствующих фаз, а затем используются селективные травители, которые воздействуют на определенные интересующие фазы или окрашивают их. Селективные травители широко используются для количественной металлографии, особенно при использовании автоматизированного устройства. В любом случае травление должно быть проведено осторожно, чтобы четко выявить микроструктуру.

Микроскоп использует линзу объектива с очень коротким фокусным расстоянием для формирования сильно увеличенного изображения. Затем это изображение просматривается с помощью окуляра с коротким фокусным расстоянием, используемого в качестве простой лупы. Основная концепция визуализации и структуры оптической микроскопии показаны на рис. 2. Оптическая система микроскопа в основном включает объектив и окуляр. Цель линзы объектива состоит в том, чтобы увеличить объект, чтобы пользователь мог ясно наблюдать за ним. Во время наблюдения образец помещается вблизи фокальной плоскости объектива в предметном пространстве, а на промежуточной плоскости сначала создается увеличенное реальное изображение образца. Промежуточная плоскость расположена в фокальной плоскости окуляра, поэтому окуляр работает как лупа для дальнейшего увеличения изображения, проецируемого на промежуточную плоскость изображения. Наконец, наблюдателю предоставляется увеличенное виртуальное перевернутое изображение.

Рис. 2. Оптический принцип формирования изображения под микроскопом

Способность оптического микроскопа создавать разделимые изображения различных точек объекта ограничена. Разрешающая способность объектива является количественной мерой этой способности. Точки ближе предела разрешения нельзя выделить как отдельные точки. Эрнст Аббе в 1873 году впервые зафиксировал значение минимального расстояния d между двумя соседними точками, позволяющее воспринимать их как разделенные уравнением «d =l/2n sin A», где «l» — длина волны света, «A» — половина угловой апертуры линзы, а n — показатель преломления среды между объектом и линзой.

В настоящее время наименьшее линейное расстояние между двумя точками объекта, для которого они могут быть разрешены объективом, фиксируется критерием Рэлея, определяемым уравнением «d =1,22 (l/2NA)», где «l» — длина волны света, а «NA» — числовая апертура объектива. И критерий Аббе, и критерий Рэлея очень похожи, поскольку числовая апертура связана с отображающей средой соотношением NA =n sin A. Максимальное значение sinA равно 1 (A =90 градусов), следовательно, теоретическая максимальная числовая апертура Объектив в воздухе (n =1) имеет числовую апертуру =1. Поскольку высокая числовая апертура является важным требованием для высокого разрешения, была разработана иммерсионная оптика. Образцы можно визуализировать на очень небольшом расстоянии от объектива через иммерсионные среды с другим показателем преломления, такие как вода (n =1,33), глицерин (n =1,47) или масло (n =1,52).

Для хорошо спроектированного микроскопа пространственное разрешение в основном определяется линзой объектива. Хотя окуляр также может увеличить изображение, он не может улучшить разрешающую способность микроскопа. Пространственное разрешение оптического микроскопа определяется уравнением Рэлея Ro =0. 62 l/n sin A, где «Ro» — минимальное разрешаемое расстояние, «l» — длина волны света, «n» — показатель преломления среды между линзой и объектом, а «A» — единица. -половина угловой апертуры объектива, а n sinA - числовая апертура объектива.

На основании приведенного выше уравнения и с учетом практических ограничений, а именно (i) использование видимого света с длиной волны от 390 нм (нанометров) до 760 нм, (ii) максимально достижимая апертура с половинным углом от 70 до 75 градусов. градусов, и (iii) требование использования иммерсионных методов с водой или маслом для увеличения показателя преломления, разрешение обычного оптического микроскопа не может превышать 200 нм.

Оптический микроскоп и упрощенный оптический тракт микроскопа показаны на рис. 3. Современный оптический микроскоп способен увеличивать объект в 1500 раз с пределом пространственного разрешения 200 нм. Оптические микроскопы можно разделить на множество различных типов по различным критериям. Например, по способу освещения различают просвечивающие и отражательные микроскопы. В просвечивающем микроскопе свет проходит через прозрачные предметы. В отражательном микроскопе источник света, установленный в верхней части микроскопической линзы, освещает непрозрачные объекты, а отраженный свет улавливается линзой. Микроскопы также можно различать на основе методов наблюдения, включая микроскопы светлого поля, микроскопы темного поля, фазово-разностные микроскопы, микроскопы с поляризованным светом, интерференционные микроскопы и флуоресцентные микроскопы.

В каждом микроскопе можно использовать как метод пропускания, так и метод отражения. Светлопольные микроскопы являются наиболее популярными и широко используемыми из всех микроскопов. При использовании этого типа микроскопа коэффициент пропускания (или поглощения) и коэффициент отражения некоторых наблюдаемых объектов меняются в зависимости от изменения рабочей среды. Амплитуда этих объектов меняется с изменением интенсивности освещения. Бесцветные прозрачные объекты видны только при изменении фазы освещенного света. Поскольку микроскопы светлого поля не могут изменять фазу света, бесцветные прозрачные образцы невидимы при использовании этого типа микроскопа.

Рис. 3. Оптический микроскоп и принцип его работы

Компоненты микроскопа

Оптические микроскопы значительно различаются по стоимости и возможностям. Отраженный свет используется для изучения металлов. Микроскопы проходящего света используются для изучения минералов и полимеров, которые также можно исследовать в отраженном свете. Оптические микроскопы также классифицируются как «прямые» и «перевернутые». Эти термины относятся к ориентации плоскости полировки образца во время наблюдения. Поскольку каждая конфигурация имеет определенные преимущества и недостатки, выбор основывается на личных предпочтениях. Самый простой оптический микроскоп — настольный (обычно вертикальный). Фотографические возможности могут быть добавлены к некоторым микроскопам в зависимости от жесткости штатива.

Доступны различные типы микроскопов, подходящие для наблюдения и фотомикроскопии. Это могут быть как достаточно простые установки, так и полноценные исследовательские микроскопы с различными режимами освещения, источниками света, микротвердыми насадками, предметными столиками и т.д. Основные компоненты оптического микроскопа приведены ниже и показаны на рис. 3.

Подсветка  система – Доступны различные источники света для оптической микроскопии. Низковольтная лампа накаливания с вольфрамовой нитью, используемая в основном в настольных микроскопах, имеет достаточную интенсивность для наблюдения, но не для фотографирования. Изменение тока в лампе регулирует интенсивность света. Системы угольно-дугового освещения, когда-то распространенные в микроскопах, были заменены источниками света с дугой или нитью накаливания. Ксеноновые дуговые источники света преобладают из-за их высокой интенсивности и цветовых характеристик дневного света. Однако интенсивность света можно регулировать только с помощью фильтров нейтральной плотности. Вольфрамово-галогенные лампы накаливания также широко используются из-за их высокой интенсивности и высокой цветовой температуры. Интенсивность света можно контролировать, изменяя силу тока или используя фильтры нейтральной плотности. Другие источники света, такие как дуговые циркониевые, натриевые, кварцево-йодные или ртутные лампы, менее распространены.

Конденсатор – Регулируемая линза без сферической аберрации и комы помещается перед источником света, чтобы сфокусировать свет в нужной точке оптического пути. Полевая диафрагма помещается перед этой линзой, чтобы свести к минимуму внутренние блики и отражения внутри микроскопа. Полевая диафрагма прикрыта до края поля зрения. Вторая регулируемая ирисовая диафрагма, апертурная диафрагма, размещается на пути света перед вертикальным осветителем.

Открытие или закрытие этой диафрагмы изменяет количество света и угол конуса света, попадающего в объектив. Оптимальное значение этой диафрагмы зависит от каждого объектива и представляет собой компромисс между контрастностью изображения, резкостью и глубиной резкости. По мере увеличения увеличения апертурная диафрагма закрывается. Открытие этой диафрагмы увеличивает резкость изображения, но снижает контрастность. Закрытие диафрагмы увеличивает контрастность, но ухудшает резкость изображения. Апертурную диафрагму нельзя использовать для уменьшения силы света. Настраивается только контрастность и резкость.

Светофильтры - Они используются для изменения света для облегчения наблюдения, для улучшения фотомикроскопии или для изменения контраста. Фильтры нейтральной плотности используются для равномерного уменьшения интенсивности света по всему видимому спектру. Доступны различные фильтры нейтральной плотности с коэффициентом пропускания от 85 % до 0,01 %. Большинство оптических микроскопов имеют выбор как минимум из двух таких фильтров.

Селективные фильтры используются для балансировки цветовой температуры источника света и пленки. Это часто необходимо для точного воспроизведения цветных изображений, в зависимости от используемого источника света и типа пленки. Зеленый или желто-зеленый фильтр широко используется в черно-белой фотографии для уменьшения влияния дефектов объектива на качество изображения. Для получения хороших результатов большинству объективов, особенно недорогим ахроматам, такая фильтрация необходима.

Поляризационные фильтры используются для получения плоскополяризованного света (один фильтр) или света с перекрестной поляризацией (два фильтра, вращающихся для получения экстинкции) для исследования некубических (кристаллографических) материалов. Оптически анизотропные материалы, такие как бериллий, цирконий, альфа-титан и уран, можно исследовать в скрещенно-поляризованном состоянии без травления. Пластину с чувствительным оттенком также можно использовать со светом со скрещенной поляризацией для усиления окраски.

Линза объектива – Он формирует первичное изображение микроструктуры и является важнейшим компонентом оптического микроскопа. Линза объектива собирает как можно больше света от образца и комбинирует этот свет для создания изображения. Числовая апертура объектива является мерой светособирающей способности линзы. Светособирающая способность увеличивается с углом «А». Настройка апертурной диафрагмы изменяет числовую апертуру конденсора и, следовательно, числовую апертуру системы.

Объективы (рис. 4) обычно устанавливаются на револьверной головке, в которую можно установить от четырех до шести объективов. В некоторых микроскопах не используются револьверные головки, и на вертикальный осветитель можно одновременно устанавливать только один объектив с помощью байонетного крепления. Вертикальный осветитель содержит отражатель или призму, которая отклоняет свет от объектива на поверхность образца. Он обычно содержит апертурную и полевую диафрагмы, а также фильтры. Вертикальный осветитель обычно обеспечивает только один или два типа освещения, например, освещение в светлом и темном поле или освещение в светлом поле и поляризованным светом. Однако теперь доступны универсальные вертикальные осветители, которые обеспечивают все типы освещения с одним вертикальным осветителем и одним набором объективов.

Длина тубуса — это длина тубуса корпуса от линии глаз окуляра до резьбы объектива. Эта длина не стандартизирована и может варьироваться. Большинство объективов предназначены для использования с трубкой определенной длины, обычно от 160 до 250 мм, и обычно не взаимозаменяемы.

Наиболее часто используемым объективом является ахромат, который сферически скорректирован для одного цвета (обычно желто-зеленого) и продольной хроматической аберрации для двух цветов (обычно красного и зеленого). Следовательно, ахроматы не подходят для цветной фотомикроскопии. Использование желто-зеленого фильтра и ортохроматической пленки дает оптимальные результаты. Однако ахроматы обеспечивают относительно большое рабочее расстояние, то есть расстояние от передней линзы объектива до поверхности образца. Рабочее расстояние уменьшается по мере увеличения увеличения объектива. Большинство производителей изготавливают объективы с большим рабочим расстоянием для специальных применений, например, в микроскопии с горячим столиком. Ахроматы не деформируются, что важно для исследований в поляризованном свете. Поскольку они содержат меньше линз, чем другие линзы с более высокой коррекцией, потери на внутреннее отражение сведены к минимуму.

Полуапохроматические или флюоритовые объективы обеспечивают более высокую степень коррекции сферических и хроматических аберраций. Следовательно, они производят изображения более высокого качества, чем ахроматы. Апохроматические объективы имеют наивысшую степень коррекции, дают наилучшие результаты и стоят дороже. Объективы Plano имеют обширную коррекцию плоскостности поля, что снижает нагрузку на глаза, и часто используются в современных микроскопах.

В системах с парфокальными линзами каждый объектив на револьверной головке находится почти в фокусе при вращении головки, что предотвращает попадание передней линзы объектива в образец при переключении линз. Многие объективы также подпружинены, что помогает предотвратить повреждение объектива. Это больше проблема с объективами с большим увеличением, поскольку рабочее расстояние может быть очень маленьким.

Некоторые объективы предназначены для использования с маслом между образцом и передней линзой объектива. Однако линзы с масляной иммерсией используются редко, так как образец и линзу после использования необходимо очищать. Однако они обеспечивают более высокое разрешение, чем можно было бы достичь, когда между линзой и образцом находится воздух. В последнем случае максимально возможная числовая апертура составляет 0,95, в то время как объективы с масляной иммерсией дают числовую апертуру от 1,3 до 1,45 числовой апертуры, в зависимости от объектива и используемого масла. Доступны увеличения от 25х до 160х. Использование масла также повышает резкость изображения, что очень важно при исследовании образцов с низким коэффициентом отражения, таких как уголь или керамика.

Рис. 4. Типы объектива и окуляра

Окуляр – Его также называют окулярной линзой. Окуляр (рис. 4) увеличивает основное изображение, создаваемое объективом. Тогда глаз может использовать полную разрешающую способность объектива. Микроскоп создает мнимое изображение образца в точке наиболее отчетливого обзора, обычно на расстоянии 250 мм от глаза. Окуляр увеличивает это изображение, позволяя получить полезное увеличение. Стандартный окуляр имеет поле зрения диаметром 24 мм, а широкопольные окуляры для плоскообъективов имеют поле зрения диаметром 30 мм, что увеличивает полезную площадь первичного изображения.

Простейшим окуляром является окуляр Гюйгена, конструкция которого была изобретена К. Гюйгенсом. Он состоит из двух плосковыпуклых линз, обращенных выпуклыми поверхностями к линзе объектива. Он подходит для использования с ахроматическими объективами малой и средней кратности. Компенсирующие окуляры используются с ахроматами с высокой числовой апертурой и объективами с более высокой коррекцией. Поскольку некоторые корректировки объектива выполняются с помощью этих окуляров, окуляр должен соответствовать типу используемого объектива.

Глазной просвет – это расстояние между хрусталиком окуляра и глазом. Для большинства окуляров зазор между глазами составляет 10 мм или менее, что недостаточно, если человек, использующий микроскоп, носит очки. Простые проблемы со зрением, такие как близорукость, можно решить с помощью точной настройки фокуса. Проблемы со зрением, такие как астигматизм, нельзя исправить с помощью микроскопа, поэтому необходимо носить очки. Доступны окуляры с высокой точкой зрения, обеспечивающие расстояние между глазами около 20 мм, необходимое для очков.

Окуляры обычно оснащены различными сетками или координатными сетками для обнаружения, измерения, подсчета или сравнения микроструктур. Окуляр увеличивает изображение сетки или сетки и основное изображение. Оба изображения должны быть в фокусе одновременно. Также производятся специальные окуляры, позволяющие проводить более точные измерения, чем с помощью масштабной сетки. Примерами являются окуляры с нитевидным микрометром или окуляры с винтовым микрометром. Такие устройства могут быть автоматизированы для прямого цифрового считывания измерений с точностью до 1 микрометра.

Обычно используется окуляр с 10-кратным увеличением, однако для получения стандартных увеличений в некоторых системах требуется другое увеличение, например 6,3-кратное. Окуляры с более высоким увеличением, такие как 1×, 15×, 20× или 25×, также полезны в определенных ситуациях. Общее увеличение находится путем умножения увеличения объектива Mo на увеличение окуляра Me (рис. 2). Если также используется система увеличения или меха, увеличение должно быть соответствующим образом изменено.

Этап – Для фокусировки и перемещения образца предусмотрен механический столик, который размещается на столике и закрепляется зажимами. Столик инвертированного микроскопа имеет сменные пластины центрального столика с отверстиями разного размера. Полированная поверхность прикладывается к отверстию для просмотра. Однако всю поверхность нельзя осмотреть, а при большом увеличении невозможно сфокусировать объектив у края отверстия из-за ограниченного рабочего расстояния. В случае прямого микроскопа образец помещается на предметное стекло на предметном столике. Поскольку полированная поверхность должна быть перпендикулярна лучу света, между дном образца и предметным стеклом помещается глина. На отполированную поверхность накладывается кусок ткани для линз, и образец вдавливается в глину с помощью выравнивающего пресса. Однако кусочки ткани могут прилипать к поверхности образца. Альтернативой, особенно удобной для смонтированных образцов, является использование кольца вместо ткани для выравнивания образца. Кольцевые формы из алюминия или нержавеющей стали того же размера, что и крепления (слегка сплющенные в тисках), садятся на основание, а не на образец.

Вертикальный микроскоп позволяет просматривать всю поверхность с любым объективом, и оператор может видеть, какой участок образца просматривается. Это полезная функция при исследовании определенных областей образцов с покрытием, сварных швов и других образцов, где необходимо исследовать определенные области. Для смонтированных образцов держатель столика с автоматическим выравниванием может исключить выравнивание образцов на глине.

Сцена должна быть жесткой, чтобы исключить вибрации. Движение столика, контролируемое микрометрами x и y, должно быть плавным и точным, поэтому обычно используется зубчатая рейка. Многие столики имеют шкалы для измерения расстояний по осям x и y. Элементы управления фокусировкой часто содержат правила для оценки вертикального движения. Некоторые устройства имеют моторизованные столики и элементы управления фокусировкой.

Круглая вращающаяся пластина предметного столика может облегчить исследование в поляризованном свете. Такие этапы, обычные для минералогических или петрографических исследований, градуированы, чтобы можно было измерить угол поворота. Прямолинейная сцена обычно размещается поверх круглой сцены.

Встать – Для настольных микроскопов требуется жесткая подставка, особенно если на приборе выполняется фотомикроскопия. Различные части микроскопа прикрепляются к штативу в собранном виде. В некоторых случаях настольный микроскоп размещается на отдельной подставке, на которой также находится фотосистема.

Дефекты объектива

Многие дефекты линз возникают из-за законов отражения и преломления. Показатель преломления линзы зависит от длины волны света, а фокусное расстояние линзы зависит от показателя преломления. Следовательно, фокусное расстояние меняется для разных цветов света. Отдельное изображение для каждой присутствующей длины волны фокусируется на разных расстояниях от линзы. Это продольная хроматическая аберрация (рис. 5). Кроме того, увеличение зависит от фокусного расстояния, изменяя размер изображения. Это боковая хроматическая аберрация (рис. 5). Эти различия должны быть устранены для получения цветных фотографий. Поскольку ахроматы имеют ограниченную коррекцию этих проблем, их следует использовать с фильтрацией желто-зеленого света для получения четких изображений. Сферическая аберрация (рис. 5) возникает, когда свет от точечного объекта на оптической оси сильнее преломляется в центре или на периферии линзы, создавая серию положений фокуса, в которых точечное изображение выглядит как круг конечной площади. . Это можно свести к минимуму, используя апертуру, которая ограничивает использование объектива центральной частью. Дизайн линз также может решить часть этой проблемы.

Поскольку поверхность изображения оптимального фокуса изогнута, для получения плоского изображения используются компенсирующие окуляры с одинаковой, но противоположной кривизной. Другие проблемы, такие как кома и астигматизм, могут ухудшить качество изображения, если их не устранить.

Рис. 5. Дефекты объектива

Разрешение

Чтобы увидеть микроструктурные детали, оптическая система должна обеспечивать адекватное разрешение или разрешающую способность и адекватный контраст изображения. Если разрешение приемлемое, но отсутствует контрастность, детали не видны. Как правило, способность различать две точки или линии, разделенные расстоянием «d», зависит от длины волны «l» падающего света и числовой апертуры NA, цели. Это соответствует уравнению «d =k.l / NA», где k равно 0,5 или 0,61. На рис. 6 показано это соотношение для k =0,61 и четырех длин волн света. Сообщалось также о других формулах. Уравнение не включает другие факторы, влияющие на разрешение, такие как степень коррекции объективов и острота зрения человека, смотрящего в микроскоп. Он основан на работе Аббе в условиях, отсутствующих в металлографии, таких как самосветящиеся точки, идеальный черно-белый контраст, исследование в проходящем свете, идеальный точечный источник света и отсутствие дефектов линзы.

Используя уравнение из предыдущего абзаца, предел разрешения для объектива с числовой апертурой 1,4 составляет около 0,2 микрометра. Чтобы увидеть линии или точки, отстоящие друг от друга на 0,2 микрометра, необходимо определить необходимое увеличение, разделив разрешающую способность объектива на разрешающую способность человеческого глаза, которую трудно определить в условиях наблюдения. Аббе использовал значение 0,3 мм на расстоянии 250 мм, которое является расстоянием от глаза для оптимального зрения. Для света со средней длиной волны 0,55 мкм необходимое увеличение в 1100 раз превышает числовую апертуру объектива. Это является источником правила 1000 NA для максимального полезного увеличения. Любое увеличение выше 1000 NA считается «пустым» или бесполезным.

Строгое соблюдение правила 1000 NA вызывает сомнения, учитывая условия, в которых оно было разработано, которые, безусловно, сильно отличаются от тех, с которыми приходится сталкиваться в металлографии. Согласно анализу Аббе, для человека, использующего оптический микроскоп с оптимальным зрением 20/20, при оптимальных условиях контраста и средней длине волны света 550 нм, наименьшее увеличение, при котором полностью используется числовая апертура объектива, составляет 550-кратную числовую апертуру. <эм>. Это устанавливает полезное минимальное увеличение для использования с данным объективом. Было высказано предположение, что верхний предел полезного увеличения для среднего человека, использующего оптический микроскоп, составляет 2200 NA, не 1000 NA.

Рис. 6. Соотношение между разрешением и глубиной резкости с числовой апертурой

Глубина резкости

Глубина резкости — это расстояние по оптической оси, на котором детали изображения видны с приемлемой четкостью. Те факторы, которые влияют на разрешение, также влияют на глубину резкости, но в противоположном направлении. Следовательно, необходимо достичь компромисса между этими двумя параметрами, что становится все труднее по мере увеличения увеличения. Это одна из причин, по которой световое травление предпочтительнее для исследования с большим увеличением.

Режимы проверки

Для достижения разрешающей способности выбранного объектива контрастность изображения должна быть адекватной. Контраст изображения зависит от подготовки образца и оптики. Различия в коэффициентах отражения света от поверхности образца создают амплитудные характеристики, видимые глазу после увеличения. Разность фаз, создаваемая отражением света, должна быть видна с помощью фазово-контрастных или интерференционно-контрастных приставок к микроскопу.

Подсветка светлого поля – Вертикальное освещение светлого поля, наиболее широко используемый метод наблюдения, составляет подавляющее большинство сделанных микрофотографий. При работе свет проходит через объектив и падает на поверхность образца перпендикулярно. Поверхностные элементы, перпендикулярные падающему свету, отражают свет обратно через объектив к окулярам, ​​где поверхностные элементы выглядят яркими. Поверхности, расположенные под углом к ​​световому лучу, отражают меньше света к объективу и кажутся темнее в зависимости от их угла.

Наклонное освещение – В некоторых микроскопах возможно децентрировать узел конденсора или зеркало, чтобы свет, проходящий через объектив, падал на поверхность образца под неперпендикулярным углом. Шероховатости на поверхности образца отбрасывают тени, создавая трехмерный вид. Это позволяет определить рельефные или углубленные элементы. Однако можно ввести очень небольшую наклонность, поскольку этот метод приводит к тому, что освещение становится неравномерным и снижает разрешение.

При освещении в темном поле – При освещении темным полем свет, отраженный от наклонно ориентированных объектов, собирается, а лучи, отраженные от объектов, перпендикулярных падающему лучу, блокируются. Следовательно, контрастность по существу обратная по сравнению с яркопольным освещением; т. е. детали, яркие при ярком освещении, кажутся темными, а обычно темные детали кажутся яркими. Это создает очень сильный контраст изображения, при этом наклонные детали кажутся светящимися. В таких условиях часто можно увидеть детали, невидимые при ярком освещении. Этот метод особенно полезен для изучения зернистой структуры. Однако низкая интенсивность света затрудняет фотомикроскопию, и эту проблему можно решить с помощью автоматических устройств управления экспозицией.

Поляризованный свет – Поляризованный свет, используемый в металлографии, обычно ограничивался наблюдением за некоторыми оптически анизотропными металлами, такими как бериллий, альфа-титан, цирконий и уран, которые трудно травить, но хорошо реагируют на поляризованный свет при правильной полировке. Before development of the electron micro-probe analyzer (EMPA) and energy dispersive spectroscopy (EDS), polarized light examination was an integral part of the method for identifying inclusions. Since the development of these instruments, polarized light has been used less frequently for this purpose, since identification with the EMPA or EDS techniques is more definitive. Most metallurgical microscopes now use synthetic Polaroid filters. The ‘polarizer’ is placed in the light path before the objective, and the ‘analyzer’ is placed in the light path after the objective, normally just below the eyepiece.

Light consists of transverse waves vibrating in all directions at right angles to the direction of propagation. These vibrations occur symmetrically around the direction of propagation and are unpolarized. When light passes through a polarizing filter, the vibrations occur in only one plane in the direction of propagation, and the light is termed plane polarized. This plane changes as the filter is rotated. When the analyzer filter is placed in the light path, plane polarized light passes through it if the plane of vibration of the light is parallel to the plane of vibration of the analyzer. If the plane of vibration of the analyzer is perpendicular to that of the light the light does not pass through, and extinction results. When plane-polarized light is reflected from the surface of an isotropic metal (any metal with a cubic crystallographic structure, such as iron), then passes through the analyzer in the crossed position (plane of vibration perpendicular to that of the plane-polarized light), the image is extinguished, or dark. However, in practice, since the metallurgical microscope does not produce perfectly plane-polarized light, complete extinction does not occur. This is not a serious problem, since polarized light is used only in a qualitative manner in metallography. Strain-free objectives, normally achromats, are to be used. Fluorite or apochromatic objectives are unsuitable. A strong white-light source is needed to produce accurate colour effects.

If an optically anisotropic, polished metal is placed under the light beam with the polarizer and analyzer crossed, the microstructure is revealed. The quality of sample preparation is very important, and the surface is to be perpendicular to the light path. Rotation of the sample under the beam changes light intensity and colour. Since it is difficult to set the polarizer and analyzer in the crossed position accurately when an anisotropic sample is in place unless the crossed positions are marked on the polarizer and the analyzer, it is best to find this position first using an isotropic sample.

When plane-polarized light strikes an anisotropic metal surface, reflection occurs as two plane-polarized components at right angles to each other. The directions vary with crystal structure. The strength of these two perpendicular reflections can change, and a phase difference exists between them. These differences vary with each metal and depend on the crystal orientation. No reflection is obtained when the basal plane of hexagonal or tetragonal crystals is perpendicular to the light beam. Maximum reflectance occurs when the principal symmetry axis of the crystal is perpendicular to the light beam. The resultant image is predominantly influenced by these orientation effects with phase differences are of little significance.

When the analyzer is crossed with respect to the polarizer, rotation of plane-polarized light from the anisotropic surface allows the light to pass through the analyzer, producing an image in which each grain has a different light intensity and colour, depending on its crystal orientation relative to the light beam. As the stage is rotated, each grain changes four times in intensity from light to dark during a 360 degree rotation. If the phase difference is appreciable, the light is elliptically polarized, the difference in intensity in each grain with rotation is less, and extinction is not observed. Colour images are obtained when the reflected plane-polarized light varies with wavelength. When little colour is present, a sensitive tint plate inserted between the polarizer and the objective enhance colouration.

Isotropic metals can be examined using crossed-polarized light if the surface can be rendered optically active by etching, staining, or anodizing. Procedures have been developed for several metals, however, all etched surfaces do not respond to polarized light. Normally, the etch s to produce etch pits or facets in each grain to cause double reflection at these features. Grains with different crystal orientations produce differently oriented pits or facets, yielding different degrees of elliptical polarization and hence varying light intensity. Anodizing produces a thick oxide film on the sample surface and irregularities in the film lead to double reflection.

Although the polarization response of anodized samples has been attributed to optical anisotropy of the film, experimentation has shown that the effect is due to film surface irregularities. Tint etchants produce surface films which result in interference colours which can be enhanced using polarized light. In general, best results are achieved when the analyzer is shifted slightly from the crossed position. In addition to its use in examining inclusions, anisotropic metals (antimony, beryllium, bismuth, cadmium, cobalt, magnesium, scandium, tellurium, tin, titanium, uranium, zinc, and zirconium, for example), and etched / anodized/ tint-etched cubic metals, polarized light is useful for examination of coated or deformed metals. Phase identification can also be aided in some cases. The internal structure of graphite nodules in cast iron is vividly revealed using polarized light. Martensitic structures are frequently better revealed using polarized light, which illustrate lath martensite in a high-strength iron-base alloy.

Phase contrast illumination – It permits examination of subtle phase variations in microstructures with little or no amplitude contrast from differences in the optical path at the surface (reflected light) or from differences in the optical path through the sample (transmitted light). Differences of height as small as 0.005 micrometers can be detected. Application of phase-contrast illumination in metallography has been limited. The technique needs a separate set of objectives and a special vertical illuminator.

Interference-contrast illumination – Differential interference-contrast illumination produces images with emphasized topographic detail similar to those observed using oblique illumination. Detail which is invisible or faintly visible using bright-field illumination can be revealed vividly with interference-contrast illumination. Examples of the topographic detail which can be revealed using differential interference-contrast illumination are the relative hardness of the constituents or the nature of the etching process, that is, which areas or constituents are attacked by the etchant. In some cases, other aspects of the structure can be revealed which are invisible or faintly visible in bright-field illumination.

Interference techniques – Several interference techniques are used to measure height differences on samples. Interference fringes on a perfectly flat surface appear as straight, parallel lines of equal width and spacing. Height variations cause these fringes to appear curved or jagged, depending on the unit used. The interference microscope divides the light from a single point source into two or more waves which are superimposed after traveling different paths. This produces interference. Two-beam and multiple-beam instruments are the two basic types of interferometers used. The measurements are based on the wavelength of the light used. Two-beam interferometers can measure height differences as small as ‘l’/20; multiple-beam interferometers, as small as ‘l’/200.

The Linnik-type interferometer is a two-beam reflecting microscope which uses non-polarized light. A beam-splitting prism produces two light beams from a monochromatic light source. One beam travels through the test piece objective to the test piece surface and is reflected back through the objective to the eyepiece. The other beam travels through the reference objective, strikes an optically flat reference mirror, and returns to the beam splitter, then to the eyepiece. If the path difference between the two beams is not equal or not a multiple of ‘l’/2, interference occurs and contour lines are formed which indicate locations of equal elevation. The height difference between adjacent fringes is ‘l’/2.

The Tolansky multiple-beam interferometer produces interference between many light beams by placing a reference mirror which is partially transmitting and partially reflecting very near the sample surface but slightly out of parallel. The reference mirror has a known reflectivity selected to approximate that of the surface. Light passes through the reference mirror and strikes the sample surface, is reflected by the sample surface, and interferes with the rays reflected between the reference mirror and the sample. The fringes produced by the multiple-beam interferometer are sharper than those from the two-beam interferometer, which accounts for the greater accuracy. The distance between the fringes is also ’l’/2. Elevations produce displacements of the fringes from parallel alignment. The displacement is compared to the distance between the fringes to obtain height measurements.

Light-section microscopy – The light-section microscope, also used to measure surface topography, complements interference techniques. Roughness differences from 1 micrometer to 400 micrometers can be measured, which is useful in examining machined surfaces and for measurement of surface layers or films. In operation, a slit is placed near the field iris in the illumination system and is imaged by an objective as a light line on the surface to be measured. Oblique illumination is used with a dark background. The light band is observed using a second objective which is identical to the first. The objectives are 45 degrees to the sample surface and 90 degrees to each other. A reticle in the eyepiece is used for measurements, or they are made on photographs. Vertical resolution is not as good as with interferometers, but lateral resolution is better.

Auxiliary techniques

Several special devices can be used with the optical microscope to get additional information. These techniques are described below.

Micro-hardness testing – Micro-indentation hardness data can be obtained by adding indenter attachments to the microscope. Single-purpose units also are made by many manufacturers of hardness test equipment. Loads are normally made from 1 g (gram) to 1,000 g, although some manufacturers have units for low loads (0.05 g to 200 g). Knoop or Vickers indenters can be used.

Hot-stage microscopy – Hot-stage microscope cells are available from several manufacturers. Single-purpose units can also be used. Cold-cell attachments have also been produced, but have rather limited use in metallography. The hot-stage microscope has been used to study phase transformations on heating or cooling or at constant temperature. Examination of reactions in the hot-stage microscope cell needs use of long-working-distance objectives, since the sample is held within the cell. Moreover, since the cell window is quartz, the objectives is to be quartz-corrected, especially those with magnifications of 20× or more.

Techniques other than chemical etching are to be used to view phase changes. Grain boundaries are to be thermally etched if the sample is held at a constant temperature in the vacuum. Grain-boundary grooving is easily observed using bright field illumination. Phase transformations are visible by the relief produced at the surface. Hence, shear reactions, such as those produced by martensite or bainite formation, are most easily observed. Other phase transformations are more difficult or impossible to observe. Transformations can be photographed in situ, for which motion picture cameras are normally used.

Special stages – These are available in a variety of configurations. Auto leveling stages for mounted samples are a typical example. Universal tilting stages have also been made for rapid manipulation of rough, irregular samples. Special stages have also been designed for handling small objects. A number of stages have been made for performing in situ experiments. Basic studies of solidification have been performed by in situ observation of the freezing of low-melting-point organic materials, such as camphene, which solidify like metals. Observation of the recrystallization of low-melting-point metals and alloys has been similarly observed. Special stages have been used to observe the progress of electrolytic polishing and etching. Cells have also been used for in situ examination of corrosion processes. Stages have been designed to observe a variety of processes involving static or dynamic stress, and devices have also been designed to permit physical extraction of inclusions.

Hot-cell microscopy – Metallographic preparation of radioactive materials needs remote-control preparation using specially designed hot cells. Special microscopes have been designed for use with the hot cell.

Field microscopy – When the microstructure of a component or large object which cannot be cut and moved to the laboratory is to be examined, portable laboratory equipment, made by several manufacturers, can be used to polish a section in situ. A portable microscope can be sometimes used to examine and photograph the microstructure. If this cannot be done, replicas can be made and examined using an optical microscope or an electron microscope.

Comparison microscopes – The need occasionally arises to compare two microstructures. Normally, this is carried out by placing micrographs from each sample side-by-side, but it can also be performed using special microscopes. A bridge comparator is used to combine images from two bench microscopes for simultaneous viewing.

Television monitors – Projection microscopes can be used for group viewing, but it is more common to display the microstructure on a black-and-white or colour monitor. A number of high-resolution closed-circuit systems are available.

Clean-room microscopy – The study of small particles is influenced by dust contamination during viewing. Hence, such work is to be performed in a clean box, clean bench, or clean room which is specially made to provide a dust free environment.

Image analyzers – The increased use of quantitative metallography, particularly for characterization of inclusions, has promoted development of automated image analysis systems based on television principles. Phases or constituents of interest are detected primarily by differences in light reflectivity which produce gray-level differences on the monitor. Majority of the stereological measurements can be made using these systems. Considerable automation has been achieved using automated stages and powerful minicomputers. Although these devices can be quite expensive, they have stimulated interest in stereology and its application to structure-property correlations.

Features are detected on as-polished or etched samples, depending on the nature of the feature of interest. If etching is needed, selective techniques are normally used. Field and feature-specific measurements are utilized. Field measurements measure all the detected features simultaneously, as in volume fraction measurements. In feature-specific measurements, each separate particle is measured sequentially. This procedure is normally used for shape and size measurements.

Some structures do not lend themselves to accurate measurements using such systems. For example, quantification of fracture surface detail cannot be performed using an automatic image analyzer, since the device cannot separate fracture features by gray level. Many transmission electron micrograph structures also cannot be analyzed using these devices. For such structures, semi-automatic tracing devices can be used with the operator performing detection with a light pen or stylus. These lower-cost systems can be used for nearly any stereological measurement. Because of the greater time needed for detection, they are less suitable for measurement problems which need sampling of many fields.

Photo-microscopy

Prior to the development of photographic attachments, microstructures were to be sketched. Although the need for such documentation is no more there, sketching remains useful as a teaching method. Photo-microscopy is important in metallography, since the photo-micrograph can faithfully reproduce the detail observed for others to view. With the equipment presently available, high-quality micrographs are easily produced. However, this needs careful attention to sample preparation, etching, and use of the microscope. Reproduction of false microstructures is all too common and has caused inaccurate interpretations, rejection of good materials, and faulty conclusions in failure analyses.

Historically, darkroom photographic procedures have been most prevalent. Since the introduction of instant photographic processes such as Polaroid, however, many photo-micrographs have been made using these materials, taking advantage of their speed and efficiency. However, image reproduction is sacrificed, and the process is to be repeated for each extra copy. Use of an automatic exposure device is necessary with instant process film to minimize waste. Traditional darkroom photographic methods need more effort, but yield better micrographs. Considerable automation in wet darkroom processes is possible, but frequent use of photo-microscopy is needed to justify the cost of such equipment.

Obtaining good micrographs needs adequate image contrast and resolution, uniform focus over the entire field, uniform lighting, and adequate depth of field. The light source is to be properly aligned, and the system is to be free of vibration. The yellow-green filter is to be employed to correct lens defects. The optics is to be clean, and the field and aperture diaphragms are to be adjusted correctly. The microscope is focused in a variety of ways, depending on the model. Several film formats can be used, such as plates, sheet film of different size, or 35-mm roll film. The magnification at the film plane is to be known. This is a simple procedure if the only variables are the objective and eyepiece magnification, but is more difficult when using a zoom system or bellows. A stage micrometer can be utilized to determine the true magnification.

A range of black-and-white and colour films is available for darkroom or instant techniques. The manufacturers of these films document film characteristics. Black-and-white films are normally used due to their lower cost. They show better contrast control, are easier to process, and are normally quicker to use than colour films. Colour film has some important uses for which its cost is justified. In traditional black-and-white photography, a negative image is produced first and is used to produce a positive image of the microstructure on suitable paper. The micrograph lasts for many years without any apparent change. Selection of the negative film is based on the format available, colour sensitivity, contrast, resolving power, speed, graininess, and exposure and development latitudes.

Some black-and-white films are not sensitive to the entire visible spectrum. Orthochromatic films are sensitive to all colours except orange and red. Panchromatic films are sensitive to all colours, although they emphasize blue and de-emphasize yellow. A yellow filter can be used to reduce this colour bias.

Orthochromatic films can be developed under dark red light, but panchromatic films need total darkness. Orthochromatic films are very good for photo-microscopy, particularly when a yellow-green filter is inserted to correct lens defects.

Film speed is a critical variable only when illumination is low, as in polarized light, interference-contrast, or dark-field illumination. Orthochromatic film has a medium contrast which is adequate for most structures. Contrast can be enhanced with a high-contrast film. The resolving power of a film defines its ability to record fine details in the image. Hence, a high-resolving-power film is desirable. Graininess depends on the size of the silver grains in the emulsion, the developer used, and the development time and temperature. High-speed films are grainier than low-speed films, making them less suitable for enlarging. Contact printing is preferred. It needs a large film size, but saves enlargement time. It produces better images and eliminates re-determining the magnification of the print. A fine-grain film provides the best resolution.

When a negative is exposed, there is an allowable range of exposures which produces a useful, printable negative. Wide exposure latitude is quite valuable. Each film includes information on its characteristic relationship between exposure time and density. The exposure selected is to be on the linear portion of the density-time curve. A good, dense negative allows suppression of some of the fine image defects during printing. An underexposed negative greatly restricts printing and normally results in a poor print. Development of negatives is rather simple and involves use of a developing solution, a stop bath, a fixing solution, as well as washing and drying.

The correct exposure is most easily determined using a built-in exposure meter. If this is not available, a test exposure series can be made. This is accomplished by pulling out the film slide completely and exposing the entire film for a time judged to be considerably shorter than that needed. The slide is then inserted so that it covers around 10 mm to 20 mm of the film, and the exposure is repeated. This is repeated incrementally until the slide is fully inserted, covering the film. After development, the correct time can be assessed based on the density of the negative in each band.

Alternatively, the step exposure can be performed using an instant film of the same speed, saving the darkroom time. Majority of the black-and-white films are contact printed. The negative is placed emulsion side up on the contact printer, and a suitable paper is placed emulsion side down over the negative. The printer is closed, and light is passed through the film onto the paper. The print is developed, stopped, fixed, washed, and dried. Print contrast is controlled by the type of paper and development time. Print contrast types vary from extra-soft (flat) to extra-contrast (grades 1 to 5). Number 3 paper is used most frequently. Number 4 paper is used to increase contrast, and No. 2 paper to reduce contrast.

Instant process films eliminate the darkroom work, thus hastening the process. Polaroid prints use the diffusion-transfer reversal process. Development begins when the film is removed from the camera after the exposure. The action of pulling the film out of the camera crushes a pod containing the viscous, caustic developer and spreads it over the film. Black-and-white films develop rapidly while the colour prints need slightly more time. Some of the Polaroid films have very high speeds, an advantage in dim lighting. Some prints are to be coated with a neutralizing stabilizer / protective varnish to prevent staining and fading. Also available are instant films which produce a negative and a positive print. This negative is to be cleared, but a darkroom is not required. Polaroid films used in microscopy are all panchromatic. They are available as roll film, film packs, or sheets. Exposure times are to be more accurately controlled to get good prints than with traditional wet-process films.

Macro-photography

Examination and photography are frequently needed for such objects as macro-etched disks and broken parts. Examination can be performed visually or with the aid of a simple hand lens or stereo-microscope. Macro-photography can be performed using majority of the cameras, perhaps aided by the use of close-up lens attachments, a bellows, or a macro-lens. Many stereomicroscopes can be equipped with cameras for photography while some takes stereo-pairs. A few manufacturers offer camera stands for macro-photography. Some metallographs also have low-magnification objectives which can perform certain types of macro-photography.

Macro-photography utilizes magnifications from less than 1× to 50×. Most laboratories, especially those engaged in failure analyses, have various cameras, light sources, and stereo-viewers to cover the wide range of objects photographed. Correct lighting is necessary to emphasize details and provide even illumination without glare or reflection. Adjustment of lighting needs some experimentation and experience. Available lighting includes flood lamps, rings, coaxial, or fiber optics. A light box is useful for eliminating shadows, but considerable creativity is needed to achieve good results.

Depth of field and resolution are important variables. Many of the objects to be photographed are three-dimensional, which needs a certain depth of field and proper lighting to reveal shape and texture. Depth of field varies with the aperture diaphragm lens setting, the magnification, and the focal length of the lens. Stopping down the aperture improves depth of field, but decreases image brightness and clarity. Depth of field also increases as magnification decreases and focal length increases. For magnifications below 5×, focal lengths of 100 mm or more are preferred. Shorter-focal-length lenses are used for higher magnifications.