Ферумокситол ослабляет функцию MDSC для улучшения иммуносупрессии, вызванной LPS, при сепсисе

Введение

FMT, добавка железа, одобренная Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, используется для лечения железодефицитной анемии у взрослых с хроническим заболеванием почек (ХБП) [1], а FMT также широко используется в качестве контрастного вещества и носителя лекарств [2] . Предыдущие исследования показали, что FMT обладает иммуномодулирующими свойствами, такими как его способность вызывать фенотипический сдвиг в макрофагах M2 в сторону высокого уровня CD86 ⁺ , TNF-α-положительный подтип макрофагов M1 [3, 4]. Однако влияние FMT на другие иммунные клетки не изучалось.

MDSC представляют собой гетерогенную популяцию незрелых миелоидных клеток с мощной иммуносупрессивной способностью [5]. У мышей MDSC идентифицируются как Gr-1 ⁺ CD11b ⁺ клетки, в то время как человеческие MDSC не имеют гомолога Gr-1 и определяются как CD14 ^- HLA-DR ^- CD11b ⁺ CD33 ⁺ или CD14 ⁺ HLA-DR ^- CD11b ⁺ CD33 ⁺ клетки [6]. MDSC состоят из двух больших групп клеток, гранулоцитарных или PMN-MDSC и M-MDSC, и обе популяции обладают иммуносупрессивными функциями за счет продукции iNOS, ROS и Arg-1. Повышенная активность Arg-1 истощает l-аргинин, а нехватка l-аргинина ингибирует пролиферацию Т-клеток за счет снижения экспрессии дзета-цепи CD3. INOS генерирует NO, который подавляет функции JAK3 и STAT6 в Т-клетках, а также экспрессию MHC II. АФК индуцирует посттрансляционную модификацию рецепторов Т-клеток и может вызывать невосприимчивость антиген-специфических Т-клеток [7]. M-MDSC возникают из предшественников моноцитов и могут дифференцироваться в макрофаги и DC в соответствующих цитокиновых условиях. Большая часть наших знаний о MDSC основана на исследованиях рака. В последние годы распространение MDSC также было описано при острых и хронических воспалительных заболеваниях, включая воспаление, ожоги и аутоиммунные заболевания [8, 9]. Недавно в исследованиях визуализации был обнаружен высокий уровень поглощения флуоресцентных наночастиц MDSC в пищеводе и селезенке мышей [10]. Однако неясно, изменяет ли FMT функцию MDSC, участвующих в развитии воспалительных заболеваний.

Сепсис, дисрегулируемая воспалительная реакция хозяина на тяжелую инфекцию, которая может вызвать опасную для жизни дисфункцию органов, является наиболее частой причиной смерти в отделении интенсивной терапии. Сепсис вызывает подавляющую провоспалительную реакцию, которая, если ее не лечить на ранней стадии, быстро трансформируется в длительную иммуносупрессию. Расширение MDSCs было описано в селезенке и лимфатических узлах на моделях септических животных [8, 11], а также у пациентов с сепсисом [12,13,14]. Активация иммуносупрессивных клеток, таких как MDSC, имеет решающее значение для надлежащего контроля гиперреактивности врожденной иммунной системы, но их избыточное распространение может привести к гипериммуносупрессии, которая является преобладающей движущей силой вторичной инфекции и смертности при позднем сепсисе. Повышенное количество MDSC коррелирует с подавлением пролиферации лимфоцитов. Сообщалось, что MDSCs приобретают свой фенотип в костном мозге, а затем мигрируют во вторичные лимфоидные органы, чтобы ингибировать ответы T-клеток и подавлять их пролиферацию у мышей с LPS-иммуносупрессией [8]. Большинство пациентов с затяжным сепсисом демонстрируют иммуносупрессивный статус, и большая часть смертности от сепсиса связана с иммуносупрессией позднего сепсиса. Удаление MDSC может иметь положительные эффекты при позднем сепсисе за счет восстановления иммунного ответа [15]. Поэтому мы предположили, что FMT может модулировать функции MDSC для снижения иммуносупрессии при позднем сепсисе.

Здесь мы показали иммуномодулирующий эффект FMT на MDSC. Мы использовали магнитные свойства FMT, чтобы показать, что MDSC способны фагоцитировать FMT in vitro. Более того, мы обнаружили, что FMT ослабляет иммуносупрессивную функцию MDSC за счет подавления Arg-1 и ROS. Кроме того, эксперименты in vivo подтвердили, что FMT улучшает позднюю стадию LPS-индуцированного сепсиса у мышей за счет ослабления способности MDSC ингибировать Т-клетки. Наши данные предполагают, что иммуномодулирующая функция FMT может использоваться для лечения иммуносупрессии, возникающей при позднем сепсисе.

Материалы и методы

Мыши

Самцов мышей C57BL / 6 (возраст 8–10 недель) были приобретены в Центре исследований модельных животных Нанкинского университета (Нанкин, Китай). Мышей выращивали в определенных условиях, свободных от патогенов (SPF), при 24-часовом цикле свет / темнота и обеспечивали свободный доступ к пище и воде. Все эксперименты с мышами были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Нанкинского университета.

Окрашивание берлинской лазурью

Внутриклеточное распределение FMT определяли с помощью набора для окрашивания берлинской синей Perl (Solarbio, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 минут, а затем инкубировали с 10% ферроцианидом калия в течение 25–30 минут с последующей промывкой и контрастным окрашиванием ядерноустойчивым красным в течение 10 минут. Клетки, содержащие синие частицы в цитоплазме, были положительными по окрашиванию берлинской лазурью.

Создание MDSC, полученных из костного мозга

Клетки костного мозга получали промыванием бедренных и большеберцовых костей мышей дикого типа с последующим лизисом эритроцитов. Клетки костного мозга культивировали в полной среде RPMI-1640 с 10% FBS, 1% об. / Об. Пенициллина и стрептомицина (Gibco, Калифорния), 40 нг / мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) (Miltenyi Biotech, Германия) и 40 нг / мл IL-6 (Miltenyi Biotech, Германия) при 37 ° C в 5% CO ₂ инкубатор на 4 дня. Неприлипающие клетки собирали для дальнейших экспериментов.

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток анализировали с использованием набора Cell Counting Kit-8 (Dojino, Kumamoto, Japan) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, MDSC (5 × 10 ³ ) помещали в 96-луночные культуральные планшеты и инкубировали в 5% CO ₂ атмосфера при 37 ° C перед обработкой. Затем среду заменяли свежей средой, содержащей различные концентрации FMT (250, 500, 1000, 2000 мкг / мл) в течение 24 часов. Затем супернатант отбрасывали и добавляли свежую среду, содержащую раствор CCK-8. После инкубирования при 37 ° C в течение 3 часов оптическую плотность измеряли при 450 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов Gen5 (BioTek, США).

Выделение общей РНК и ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК экстрагировали из клеток с помощью реагента TRIzol (Invitrogen, США) и количественно оценивали с помощью спектрофотометра Nanodrop (Thermo Scientific, США) перед обратной транскрипцией с использованием набора HiScript II для синтеза 1-й цепи кДНК (Vazyme Biotech Co., Ltd, Китай). согласно инструкции производителя. Количественную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени проводили с использованием набора SYBR Green PCR Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) на системе qPCR в реальном времени Applied Biosystems StepOne-Plus (Applied Biosystems, Forster City, CA). Экспрессию гена нормализовали по GAPDH с использованием 2 ^-ΔΔCt метод. Последовательности праймеров перечислены в Дополнительном файле 1:Таблица S1.

Проточная цитометрия

Ткани готовили в виде суспензий одноклеточных с коллагеназой типа D (1 мг / мл) и ДНКазой I (0,1 мг / мл) в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) при 37 ° C в течение 30 мин, а затем с эритроцитами селезенка лизировалась. Суспензии клеток фильтровали через сетчатые фильтры размером 70 мкм, и лимфоциты собирали центрифугированием при 300 g в течение 5 мин при 4 ° C. После отмывки клетки немедленно готовили для сортировки клеток с активацией флуоресценции. Отдельные клетки инкубировали с реагентом, блокирующим FcR (Miltenyi Biotech, Германия), в течение 10 мин с последующим окрашиванием следующими конъюгатами антител в течение 20 мин:меченные FITC анти-CD11b, анти-CD11c, анти-CD4 и анти-CD8; PE-меченные анти-Ly6G; Меченные APC анти-Ly6C, анти-CD3, анти-F4 / 80 и анти-MHC II (BioLegend, Калифорния). После промывки клетки были обнаружены с помощью FACS Calibur (BD, CA), и данные были проанализированы с помощью FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., США)

Окрашивание H&E

Ткани печени и легких фиксировали в 4% забуференном фосфатом формальдегиде. Фиксированную ткань заливали парафином, а срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином для световой микроскопии.

Иммуноферментный анализ

Уровни TNFα, MCP-1 и IL-1β в сыворотке определяли с использованием специальных наборов для ELISA (Dakewe, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Каждый образец был запущен в двух экземплярах.

Обнаружение ROS

Внутриклеточные ROS измеряли с помощью набора 2,7-дихлородигидрофлуоресцеина диацетата (DCFH-DA) (Beyotime, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки дважды промывали PBS и инкубировали с 5 мкМ DCFH-DA при 37 ° C в темноте в течение 30 мин, затем промывали средой RPMI-1640 и ресуспендировали в PBS. Клетки анализировали на внутриклеточную зеленую флуоресценцию с помощью проточного цитометра (BD, CA).

Анализ пролиферации Т-клеток

Всего CD3 ⁺ Т-клетки обогащали из селезенок мышей дикого типа с использованием набора CD3ε MicroBead (Miltenyi Biotech, Германия) и инкубировали краситель CFSE (Invitrogen, США). Для индуцированной анти-CD3 / CD28-антителом пролиферации Т-клеток Т-клетки активировали анти-CD3-антителом (1 мкг / мл) и анти-CD28-антителом (1 мкг / мл). G-MDSC (Gr-1 ^high Ly-6G ⁺ ) и M-MDSC (Gr-1 ^dim Ly-6G ^- ) выделены из селезенки мышей, обработанных FMT или обработанных носителем, с использованием набора для выделения миелоидных супрессорных клеток (Miltenyi Biotech, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. MDSC совместно культивировали в соотношении 1:1 с CD3, меченным CFSE ⁺ Т-клетки в 96-луночных планшетах с плоским дном в течение 3 дней. CFSE делится поровну между дочерними клетками при каждом делении; поэтому пролиферацию определяли с помощью проточной цитометрии. Чистота клеток после сортировки составила> 90%.

Статистика и анализ данных

Все статистические данные были рассчитаны с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, CA) и представлены как средние значения ± стандартное отклонение (SD). Различия между двумя группами были проанализированы методом Манна – Уитни U тест или непарный, двусторонний Студент t контрольная работа. Односторонний дисперсионный анализ ANOVA использовался для сравнения нескольких групп. Все эксперименты повторяли не менее трех раз. Отличия от p значения <0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

FMT приема большого количества MDSC

Чтобы проверить, разделяются ли клетки с интернализованным FMT с помощью MACS MicroBeads, мы использовали окрашивание берлинской лазурью для определения содержания внутриклеточного железа в макрофагах, обработанных FMT (1000 нг / мл) в течение 24 часов. Клетки были разделены на три группы:перед магнитной сепарацией, FMT-положительные клетки, которые были отобраны с помощью магнитного поля (FMT +), и те, которые не были изолированы с помощью магнитного поля (FMT-). Окрашивание берлинской синей продемонстрировало, что большинство клеток, отобранных с помощью магнитного поля, были положительными для берлинской синей (рис. 1а). Чтобы сравнить способность фагоцитировать FMT между MDSC, макрофагами и DC, мы выделили спленоциты от наивных мышей C57BL / 6, получавших FMT в течение 6 часов, 12 часов, 24 часов и 48 часов. Спленоциты были разделены на две подгруппы:до магнитной сепарации и FMT-положительные клетки. Анализ проточной цитометрии показал, что почти 60% MDSC и более 60% макрофагов накапливают FMT через 12–48 часов (рис. 1b, c). Только примерно 40% DC были FMT-положительными через 24 часа. Эти данные показали, что, как и макрофаги, MDSC могут поглощать FMT и предположили, что FMT может влиять на функцию MDSC.

Способность MDSC, макрофагов и DC поглощать FMT. а Макрофаги обрабатывали FMT (1000 нг / мл) в течение 24 часов, затем окрашивали берлинской синей, чтобы установить клеточное присутствие и отложение железа среди трех групп:перед магнитной сепарацией, магнитной селекцией (FMT +), без магнитной изоляции (FMT-) . б Спленоциты от наивных мышей C57BL / 6 инкубировали с FMT в течение 6, 12, 24 и 48 часов. FACS-анализ процентного содержания MDSC, макрофагов и DC в двух подгруппах:до магнитной сепарации, FMT-положительные клетки. c Отношение FMT-положительных клеток к клеткам до магнитной сепарации. Все данные представляют три независимых эксперимента для каждой экспериментальной группы и отображаются как среднее ± стандартное отклонение

FMT запрещает распространение MDSC in vitro

Сообщалось, что FMT вызывает фенотипический сдвиг в макрофагах M2 в сторону высокого уровня CD86 ⁺ , TNF-α-положительный подтип макрофагов M1 [3]. Поскольку существует большое количество MDSC, которые могут использовать FMT, мы предположили, что FMT может изменять функцию MDSC. Во-первых, цитотоксические эффекты FMT при 250, 500, 1000 и 2000 мкг / мл на MDSC были оценены с помощью анализа жизнеспособности клеток CCK8. Результаты показали, что FMT не влиял на жизнеспособность клеток при низких дозах и проявлял лишь умеренную цитотоксичность при максимальной дозе 2000 мкг / мл (рис. 2а). Затем мы проверили, может ли FMT в различных концентрациях влиять на образование MDSC. Клетки костного мозга, выделенные от наивных мышей C57BL / 6, обрабатывали средой или различными концентрациями FMT (250, 500, 1000 и 2000 мкг / мл) в течение 4 дней с последующей характеристикой проточной цитометрией на 4 день. GM-CSF и ИЛ-6 добавляли в день 0. Результаты трех независимых экспериментов показали, что FMT при 1000 и 2000 мкг / мл значительно снижает рост MDSC (рис. 2b, c).

Количественное определение процентного содержания CD11b ⁺ проточной цитометрией Гр-1 ⁺ клетки после обработки FMT при 250, 500, 1000, 2000 мкг / мл in vitro. а Жизнеспособность клеток MDSC определяли с помощью анализов CCK8 после обработки FMT в различных концентрациях в течение 24 часов. б , c Клетки костного мозга, выделенные от мышей C57BL / 6, культивировали в течение 4 дней с GM-CSF и IL-6 в присутствии различных концентраций FMT, и фенотипы клеток оценивали с помощью проточной цитометрии. Все данные представляют три независимых эксперимента для каждой экспериментальной группы и отображаются как среднее значение ± стандартное отклонение. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, как определено t непарного Студента тест по сравнению с клетками, обработанными только носителем

FMT снижает иммуносупрессивную способность MDSC

MDSC используют несколько механизмов для подавления пролиферации и эффекторной функции Т-клеток, из которых лучше всего описано производство ROS и Arg-1. Экспрессия компонента p47phox никотинамидадениндинуклеотидфосфат-оксидазного комплекса (NOX) отвечает за продукцию ROS в MDSC [5]. Сообщалось, что S100A8 / A9 синтезируется и секретируется MDSC в аутокринной воспалительной петле, и что это важно для подавления функции дендритных клеток на моделях мышей [16]. Чтобы определить, может ли FMT изменять функцию MDSC, мы получили MDSC, полученные из BM, как описано ранее, и использовали RT-PCR для измерения экспрессии мРНК в MDSC, обработанных FMT, по сравнению с необработанными контролями. Результаты показали, что MDSC, обработанные FMT, значительно подавляли уровни экспрессии Arg-1, S100A8, S100A9 и p47phox по сравнению с необработанными MDSC (рис. 3a-h). Затем мы оценили уровни ROS в контрольных MDSC и MDSC, обработанных FMT. Результаты показали, что MDSC, обработанные FMT, показали значительно более низкий уровень ROS, чем контрольные клетки (рис. 3i, j). Впоследствии мы сравнили изменения в субпопуляциях MDSC в группах, получавших FMT, и в группах, не получавших лечения. Результаты показали, что FMT снижает процент G-MDSC, при этом также наблюдается небольшое увеличение M-MDSC (рис. 3k, l).

FMT изменяет функцию MDSC in vitro. Полученные из костного мозга MDSC, обработанные носителем или FMT в течение 24 часов. а - ч Экспрессия генов Arg-1, S100A8, S100A9 и p47phox в обработанных MDSC, измеренная с помощью количественной ОТ-ПЦР. я Полученные из BM MDSC инкубировали с FMT в течение 24 ч, и продукцию ROS определяли с помощью FCM. j Количественные данные i . к Субпопуляции MDSC в группе, получавшей FMT, и в контрольной группе. l FACS-анализ процентного содержания G-MDSC и M-MDSC. Все данные представляют три независимых эксперимента для каждой экспериментальной группы и отображаются как среднее значение ± стандартное отклонение. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, как определено t непарного Студента тест по сравнению с клетками, обработанными только носителем

FMT способствует дифференцировке MDSC в макрофаги

Чтобы определить, стимулирует ли FMT окончательную дифференцировку MDSC в макрофаги, мы обработали клетки 1000 мкг / мл FMT в день 0 и провели проточную цитометрию для маркеров, связанных с макрофагами CD11b и F4 / 80 в дни 1, 3 и 5.. результаты показали, что через 1 день после добавления 1000 мкг / мл FMT доля макрофагов значительно увеличилась более чем в 2 раза по сравнению с необработанными клетками. Точно так же через 3 дня и 5 дней после лечения FMT пропорции макрофагов также значительно увеличились (рис. 4a, b).

Влияние FMT на дифференцировку MDSC. а , b Полученные из костного мозга MDSC обрабатывались с использованием или без FMT 1000 мкг / мл, а количество макрофагов оценивалось через 1 день, 3 дня и 5 дней с помощью FACS. Все данные представляют три независимых эксперимента для каждой экспериментальной группы и отображаются как среднее значение ± стандартное отклонение. * p <0,05 по сравнению с клетками, обработанными только носителем

FMT облегчает симптомы у мышей с LPS-индуцированным сепсисом

Сообщалось, что сепсис связан с повреждением тканей и приводит к органной недостаточности и эндотелиальной дисфункции [17]. Чтобы выяснить, снижает ли FMT симптомы позднего сепсиса, через 10 дней оценивали степень повреждения органов у экспериментальных мышей. Гистопатологическое исследование легких при LPS-индуцированном сепсисе показало, что FMT снижает рекрутинг лейкоцитов и утолщение альвеолярной стенки по сравнению с мышами, получавшими носитель. Окрашивание H&E также показало, что площадь некроза печени была меньше у мышей, получавших FMT, по сравнению с мышами, получавшими носитель (фиг. 5a, b). Более того, уровни аспартаттрансаминазы в сыворотке, используемые в качестве биохимического маркера дисфункции печени у этих животных, были значительно ниже в печени мышей, получавших FMT, по сравнению с контролем (фиг. 5c). Однако FMT не влиял на уровни аланинаминотрансферазы (рис. 5d). Кроме того, считается, что сепсис связан с такими неблагоприятными исходами, как повышенная продукция воспалительных цитокинов; поэтому мы оценили изменения уровней провоспалительных цитокинов в сыворотке крови. Уровень TNF-α в сыворотке был немного, но не значительно, ниже у мышей, получавших FMT, через 3 часа после инъекции LPS, и не наблюдали различий в уровнях MCP-1 или IL-1β между мышами, получавшими FMT, и носителем. -обработанных мышей (рис. 5e – g).

FMT улучшает повреждение печени у мышей с LPS-индуцированным сепсисом. а Мыши получали либо PBS, либо i.p. инъекция 5 мг / кг массы тела бактериального LPS в день 0. Через 1 час и 5 дней FMT в дозе 10 мг / кг или 100 мкл физиологического раствора вводили через хвостовую вену. Мышей разделили на четыре группы ( n =6):управляющая, принимающая машина; LPS, принимающий только LPS; FMT, принимающий только FMT; и LPS + FMT, принимающий LPS и FMT. б Ткани легких и печени окрашивали гематоксилином и эозином. c-d Были измерены сывороточные трансаминазы (АЛТ и АСТ) ( n =6). Уровни цитокинов (TNF-a, IL-1β и MCP-1) измеряли с помощью ELISA. е - г Влияние индуцированного ЛПС сепсиса на продукцию цитокинов у мышей, получавших носитель или ферумокситол. Уровни цитокинов, измеренные с помощью ELISA в сыворотке мышей, обработанных носителем или ферумокситолом, после внутрибрюшинного введения. Проба ЛПС (50 мг / кг). ** p <0,01, как определено t непарного студента тест

FMT снижает количество MDSC в селезенке мышей с LPS-индуцированным сепсисом

Все больше данных подтверждают, что иммуносупрессия, связанная с сепсисом, увеличивает смертность [18], а MDSC считаются основным компонентом иммуносупрессивной сети [8]. Сообщалось, что G-MDSCs более специфично расширяются у пациентов с сепсисом и, по-видимому, являются основными участниками индуцированного сепсисом подавления иммунитета [12]. Чтобы определить, модулирует ли FMT популяции MDSC у мышей дикого типа, мышам C57BL / 6 вводили FMT через хвостовую вену в 1 час и 5 день. Результаты показали, что не было обнаружено значительных различий в процентном содержании MDSC в селезенке или кости. костный мозг между контрольной и обработанной FMT мышами (рис. 6a, e). Следует отметить, что FMT уменьшил LPS-зависимую экспансию CD11b ⁺ Гр-1 ⁺ клеток как в костном мозге, так и в селезенке (рис. 6a, e), что согласуется с исследованиями in vitro. Более того, FMT также снизил процент G-MDSC и M-MDSC в селезенке, в то время как только процент G-MDSC был уменьшен в костном мозге (рис. 6c, g). Эти данные показывают, что FMT снижает количество MDSC в селезенке мышей с LPS-индуцированным сепсисом.

FMT снижает количество MDSC у мышей с LPS-индуцированным сепсисом. Мышей разделили на четыре группы ( n =6):управляющая, принимающая машина; LPS, принимающий только LPS; FMT, принимающий только FMT; и LPS + FMT, принимающий LPS и FMT. а CD11b ⁺ Гр-1 ⁺ популяции клеток в костном мозге были обнаружены с помощью FACS. б Количественные данные а . c Точечный график проточной цитометрии экспрессии Ly6C и Ly6G в закрытом CD11b ⁺ клетки селезенки. г Количественная оценка процентного содержания субпопуляций гранулоцитов и моноцитов. е CD11b ⁺ Гр-1 ⁺ популяции клеток в селезенке были обнаружены с помощью FCM. е Количественные данные е . г Точечный график проточной цитометрии экспрессии Ly6C и Ly6G в закрытых клетках CD11b + селезенки. ч Количественная оценка процентного содержания субпопуляций гранулоцитов и моноцитов. * p <0,05, как определено t непарного Студента тест

FMT снижает иммуносупрессивные свойства Т-лимфоцитов у MDSC In vivo

Численное сокращение популяций множества иммунных клеток, включая CD4 и CD8 Т-клетки, является основной характеристикой адаптивного иммунного ответа после сепсиса. Это связано с повышенным риском смерти, а также с другими неблагоприятными исходами [19, 20]. Было показано, что MDSC подавляют пролиферацию Т-клеток, нарушая экспрессию дзета-цепи Т-клеток у пациентов с сепсисом [21]. Чтобы оценить долю лимфоцитов в поздней стадии сепсиса, мы измерили долю CD4 и CD8 Т-клеток в модели мышиного сепсиса. Результаты показали, что FMT вызывал увеличение CD4 и CD8 Т-клеток в селезенке мышей, индуцированных LPS (рис. 7a, b). Не было различий в процентном содержании CD4 и CD8 Т-клеток в селезенке мышей, получавших FMT, по сравнению с контрольными мышами (рис. 7a, b). Для дальнейшего подтверждения роли MDSC в подавлении пролиферации Т-клеток in vivo, G-MDSC и M-MDSC были выделены из селезенок мышей, зараженных носителем или FMT и обработанных LPS, с помощью MACS и совместно культивированы с CD3 T-клетками в соотношении 1:1. соотношение. Наши результаты показали, что лечение FMT снижает иммуносупрессивные функции Т-клеток как G-MDSC, так и M-MDSC (рис. 7e, f). Кроме того, мы также измерили уровни экспрессии Arg-1 и p47phox в MDSC, выделенных из селезенки мышей. Как и ожидалось, экспрессия генов Arg-1 и p47phox была значительно снижена в CD11b ⁺ селезенки. Гр-1 ⁺ клетки, выделенные от мышей, обработанных FMT, и мышей, зараженных LPS, по сравнению с мышами, обработанными LPS (фиг. 7g, h). Эти данные показывают, что FMT снижает иммуносупрессивные функции MDSC за счет уменьшения продукции Arg-1 и ROS, что позволяет предположить, что FMT может снизить долгосрочную иммуносупрессию при поздней стадии сепсиса.

FMT снижает иммуносупрессивные свойства MDSC. а CD3 ⁺ CD4 ⁺ популяции клеток в селезенке были обнаружены с помощью FACS. б Количественные данные а . c CD3 ⁺ CD8 ⁺ популяции клеток в селезенке были обнаружены с помощью FACS. г Количественные данные а . е Способность G-MDSC мышей подавлять пролиферацию Т-клеток, индуцированную стимуляцией анти-CD3 / CD28, измеряли с помощью FACS ( n =3 на группу). Показана характерная гистограмма. е Способность M-MDSC от мышей, обработанных носителем или FMT и зараженных LPS, подавлять пролиферацию Т-клеток, индуцированную стимуляцией анти-CD3 / CD28, измеряли с помощью FACS ( n =3 на группу). Показана характерная гистограмма. г , ч Экспрессия мРНК Arg-1 и p47phox в MDSC от мышей, зараженных LPS, обработанных носителем или FMT

Обсуждение

Утвержденная FDA добавка железа FMT широко используется в качестве носителя лекарств и контрастного вещества при МРТ-сканировании. Было обнаружено, что FMT подавляет рост рака, вызывая провоспалительный иммунный ответ с поляризацией макрофагов M1 [3], что указывает на то, что FMT обладает иммуномодулирующими функциями. В этом исследовании мы оценили влияние FMT на MDSC, сравнивая фенотип и функцию MDSC, обработанных FMT, с контрольными необработанными MDSC. Предыдущие исследования показали, что MDSCs способны захватывать магнитные наночастицы [10], а наши данные дополнительно продемонстрировали, что FMT ослабляет иммуносупрессивные функции MDSC в селезенке посредством подавления Arg-1 и ROS. Наши данные также показали, что FMT оказывает прямое влияние на дифференцировку MDSC, при этом примерно пятая часть клеток равномерно дифференцируется в макрофаги через 5 дней в экспериментах in vitro. Хотя мы не исследовали фенотип макрофагов, подвергшихся воздействию FMT, мы предположили, что они принадлежали к провоспалительному подтипу M1. Результаты ясно продемонстрировали, что FMT улучшает дифференцировку и созревание MDSC, и, таким образом, предполагает, что это лежит в основе сокращения популяции MDSC, которое мы наблюдали во время позднего сепсиса.

Сепсис инициирует сложный иммунный ответ, который меняется со временем и сопровождается как провоспалительным, так и противовоспалительным ответом. Предыдущие исследования показали, что смерть на ранних стадиях сепсиса происходит из-за чрезмерного воспаления. Derive и соавторы сообщили, что адаптивный перенос MDSC на 10-й день мышам с сепсисом снижает продукцию цитокинов в брюшной полости и повышает выживаемость [22]. Совсем недавно Namkoog et al. наблюдали, что предварительная обработка кларитромицином увеличивала выживаемость у мышей с LPS-индуцированным шоком за счет увеличения CD11b ⁺ Гр-1 ⁺ популяция клеток [23]. They described that MDSCs play a protective role in sepsis, however, it should be noted that they were concerned about the early stages of sepsis. Most patients with sepsis display rapid signs of profound immunosuppression, and deaths in this phase are typically due to the acquisition of a secondary hospital-acquired infection, often with opportunistic pathogens [24]. Overzealous MDSC proliferation may facilitate a physiological syndrome of persistent immunosuppression, causing poor outcomes [25]. McClure et al. reported that they did not observe any protective effects from MDSC transfer once the mice entered the late immunosuppressive state [26]. They had previously shown that MDSCs massively expand in the bone marrow, spleen, and lymph nodes of mice with ongoing septic processes and contribute to sepsis-induced T cell suppression [11]. Additionally, Uhel reported that M-MDSCs and G-MDSCs strongly contribute to T cell dysfunction in patients with sepsis [12]. Our data demonstrated that FMT significantly decreased the percentage of MDSCs and attenuated the functions of MDSCs to restore the number of T cells present in mice during late sepsis. Therefore, when studying the role of MDSCs in sepsis, it is crucial to clearly distinguish the early and late stages of sepsis.

Mohus et al. suggested that iron deficiency was associated with increased risk of future bloodstream infections that cause sepsis, indicating that the immune defense mechanisms may be depressed compared to bacterial iron sequestration in low iron environments [27]. Controversies shown in iron supplemental studies reported that intravenous iron therapy was associated with an increased risk of infection [28]. It should be noted the iron supplements differ significantly in their physicochemical properties, which give them different biological properties [29]. With FMT, an iron core is wrapped in a carbohydrate shell, which leads to low toxicity, lysosomal uptake and degradation [30, 31]. It has been reported that FMT does not cause liver toxicity in patients or animal models and is typically metabolized within 2 months [32]. Our data showed that FMT does not increase the production of inflammatory cytokines in early sepsis, indicating that FMT can be administered in sepsis.

Conclusion

This study demonstrated a novel immune-modulatory property of FMT; however, further studies are needed to elucidate the mechanism of FMT suppression of MDSCs. Furthermore, we provide an attractive therapeutic approach for the treatment of sepsis-associated immunosuppression and targeting MDSCs may provide a promising new option for restoring the immune response during sepsis.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, использованные и / или проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Сокращения

ALT:

Alanine aminotransferase

Arg1:

Arginase 1

AST:

Aspartate aminotransferase

FMT:

Ferumoxytol

G-MDSCs/PMN-MDSCs:

Polymorphonuclear MDSCs/granulocytic MDSCs

HE:

Hematoxylin–eosin

IL-1β:

Interleukin-1β

iNOS:

Inducible nitric oxide synthase

LPS:

Lipopolysaccharide

MCP 1:

Monocyte chemotactic protein 1

MDSC:

Myeloid-derived suppressor cell

MHC II:

Major histocompatibility complex

M-MDSCs:

Monocytic MDSCs

PBS:

Phosphate-buffered saline solution

ROS:

Активные формы кислорода

TLR:

Toll-like receptor

TNF-α:

Tumor necrosis factor α