Биосовместимые хитозановые нанопузырьки для направленной доставки доксорубицина с помощью ультразвука

Фон

В настоящее время химиотерапия используется в качестве основного метода лечения злокачественных новообразований и существенно улучшает выживаемость онкологических больных. Тем не менее эффективность химиотерапевтических препаратов ограничивается их побочными эффектами, такими как системная токсичность [1]. Местная доставка химиотерапевтических препаратов может снизить их токсичность, увеличивая их терапевтическую дозу в целевых участках и снижая уровни циркулирующих лекарств в плазме. Благодаря своей неинвазивности и нацеленности, направленное ультразвуком разрушение нано / микропузырьков (UTN / MD) широко используется в качестве эффективной системы доставки лекарств.

По сравнению с традиционными микропузырьками, наноразмерные частицы могут легче пересекать стенку капилляра и, следовательно, более эффективно доставляться к месту назначения. НБ были использованы в исследовании таргетной терапии, например НБ, нагруженные 5-фторурацилом, протестированы для использования при гепатоцеллюлярной карциноме [2]. Шен и др. недавно были использованы опосредованные ультразвуком NB для доставки ресвератрола в клетки пульпозного ядра [3], а NB также использовались при лечении рака груди [4].

Нанопузырьки (НП), используемые в UTN / MD, обычно состоят из газового ядра и стабилизированной оболочки. В составе оболочки используются липиды, поверхностно-активные вещества, полимеры или другие материалы. В предыдущих исследованиях были созданы различные типы NB. Однако многие химические вещества, используемые для образования NB или наночастиц, представляют потенциальную угрозу для человеческого организма. Следовательно, транспорт некоторых наночастиц привел к неудовлетворительной терапевтической эффективности и токсичности для нормальных тканей и клеток [5]. Химические вещества, такие как Твин 80 и глутаральдегид, обладают высокой токсичностью и представляют мутагенный риск, что ограничивает их клиническое применение [6, 7]. PLA, другой материал, используемый в NB, в некоторых случаях может вызывать побочные клинические эффекты [8]. В этом контексте важно учитывать биосовместимость и безопасность материалов, используемых для сборки НБ.

Полисахарид хитозан привлек внимание своим природным происхождением, биоразлагаемостью, биосовместимостью, исключительно низкой иммуногенностью, антибактериальной активностью и практичностью [9, 10]. Хитозан представляет собой N-деацетилированное производное хитина, который является одним из самых распространенных биологических материалов на Земле [11]. Кроме того, предыдущее исследование показало, что в присутствии IFN-γ водорастворимые олигомеры хитозана могут активировать макрофаги для уничтожения раковых клеток [12]. Таким образом, сам хитозан обладает как прямым, так и непрямым противоопухолевым действием, что делает его более подходящим в качестве носителя для противоопухолевых препаратов. Другими материалами, которые мы использовали в наших НБ, были лецитин и пальмитиновая кислота, которые являются отличными кандидатами для использования в НБ [13]. Пальмитиновая кислота является одной из самых распространенных насыщенных 14-, 16- и 18-углеродных жирных кислот, обычно синтезируется ацетил-КоА и обладает низкой токсичностью и высокой биосовместимостью [14]. Лецитин - это природное поверхностно-активное вещество, в основном получаемое из соевых бобов [15]. Предыдущие исследования показали, что соевый лецитин полезен для здоровья благодаря своим гипохолестеринемическим свойствам. Например, соевый лецитин помогает снизить риск сердечно-сосудистых заболеваний, а очищенная соя может использоваться для инкапсулирования низина [16, 17]. В этом исследовании мы использовали вышеуказанные материалы для создания биосовместимых НБ. С помощью ультразвука для доставки гидрохлорид доксорубицина (DOX) был использован в качестве модельного лекарственного средства для тестирования способности загружать лекарство новых биогенных хитозановых NB, которые были функционализированы до оценки в Michigan Cancer Foundation-7 (MCF- 7) клетки рака груди. Кроме того, после UTN / MD оценивали противоопухолевые эффекты DOX-NB.

Материалы и методы

Материалы

НБ, описанные в этом исследовании, были сконструированы с использованием перфторпропана (C3F8, Центр исследований и разработок специальных газов Научно-исследовательского института физико-химической инженерии ядерной промышленности, Пекин, Китай) в качестве ядра и хитозанового покрытия в качестве оболочки. Кроме того, Эпикурон 200 (соевый лецитин, содержащий 95% дипальмитоилфосфатидилхолина, Лукас Мейер, Гамбург, Германия), этанол (аналитическая чистота, Хуши, Китай), гидрохлорид доксорубицина (Sigma-Aldrich, Миссури, США), хитозан (100 ~ 300 кДа). , Bozhihuili, Qingdao, China) и пальмитиновая кислота (JINDU, Шанхай, Китай) также использовались в этом исследовании. Pluronic F68 был приобретен у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США).

Мобильная линия

Клеточная линия карциномы молочной железы человека MCF-7 была получена из Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд, США) и культивирована в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (FBS) (Gibco, Carlsbad). , Калифорния, США). Клетки культивировали при 37 ° C, 5% CO ₂ . и влажностью 95%. Клетки в фазе логарифмического роста собирали для экспериментов.

Приготовление NB хитозана, содержащего DOX

НБ были изготовлены по ранее описанным методикам [18, 19]. Хитозан со средней молекулярной массой (100 ~ 300 кДа) использовался для оболочек DOX-NB, а перфторпропан использовался для сердцевины. Для приготовления раствора DOX-хитозана соответствующую дозу DOX растворяли в сверхчистой воде и к водному раствору хитозана добавляли 2 мл раствора DOX (1 мг / мл) путем перемешивания с помощью вихревой мешалки в течение 5 с. Раствор DOX-хитозана инкубировали 1 ч при 65 ° C. Отдельно к водному раствору пальмитиновой кислоты добавляли этанольный раствор, содержащий эпикурон 200. После добавления соответствующего объема сверхчистой воды систему пальмитиновая кислота-эпикурон 200 гомогенизировали с использованием вихревой мешалки. Впоследствии система пальмитиновая кислота-эпикурон 200 была разделена на 1,5-мл пробирки Эппендорфа (пробирки EP), и воздух в пробирке был заменен перфторпропаном с использованием 10-миллилитрового шприца с длинной тонкой иглой. Каждая трубка колебалась в течение 120 с в механическом осцилляторе (смеситель Ag и Hg, Сиань, Китай). Затем всю жидкость из 1,5 мл пробирок EP выливали в центрифужную пробирку и объединяли с раствором DOX-хитозана на ледяной бане. Затем смесь инкубировали 30 мин при -4 ° C. Затем водный раствор Плюроника F68 (0,01%, w / w ), стабилизирующий агент, добавляли к указанной выше смеси при перемешивании. Затем была проведена стадия диализной очистки (центрифужная пробирка для ультрафильтрации, Millipore, 30 кДа) для удаления любого остаточного свободного DOX.

Наблюдение за физическими свойствами NB

Суспензию DOX-NB разбавляли, добавляя соответствующее количество PBS (фосфатно-солевой буфер). Затем форму DOX-NB наблюдали и отображали под флуоресцентным микроскопом, оснащенным масляно-иммерсионным объективом × 100 (OLYMPUS BX41, Olympus Corporation, Япония). Флуоресцентные изображения оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа (Nikon TE2000-S, Япония). Морфологию DOX-NB также наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ) (JEOL, Токио, Япония). Водные суспензии разбавленных нанопузырьков распыляли на медную сетку, покрытую формваром, и окрашивали 4% w / v уранилацетат в течение 10 мин. Затем образцы были визуализированы и отображены с помощью ПЭМ. Размер и дзета-потенциал поверхности DOX-NB измеряли с помощью анализатора размера частиц и дзета-потенциала Delsa Nano C (Beckmann Instruments, США). Все измерения были выполнены в трех экземплярах для расчета среднего значения.

Стабильность DOX-NB

Размер и морфология DOX-NB измеряли с течением времени, чтобы наблюдать стабильность этих нанопузырьков. Некоторые части DOX-NB хранили в холодильнике при 4 ° C в течение 24 или 48 часов. Остальные выдерживали при комнатной температуре 6 ч. Стабильность нанопузырьков при 25 ° C также исследовали в лиофилизированной сыворотке человека (Seronorm ™ Human, Норвегия). Для этого к 1 мл сыворотки добавляли 1 мл водной суспензии DOX-NBs и инкубировали 6 ч при 25 ° C. Затем все DOX-NB были измерены путем морфологического анализа с использованием оптической микроскопии для оценки целостности их структур. Размер NB измеряли с помощью анализатора размера частиц и дзета-потенциала Delsa Nano C (Beckmann Instruments, США).

Определение емкости NB по загрузке DOX

Стандартная кривая концентрации DOX была построена с использованием серийных разведений DOX при концентрациях 0,025, 0,05, 0,1 и 0,2 мг / мл и измерена с помощью УФ-спектрофотометра (UV-2450, SHIMADZU). Впоследствии эффективность загрузки DOX оценивали при 480 нм с использованием холостых NB в качестве контроля, и концентрацию DOX в DOX-NB рассчитывали на основе стандартной кривой, установленной выше. Чтобы избежать фотодеградации DOX в процессе очистки и измерения, все процедуры выполнялись в защищенном от света месте. Затем суспензию DOX-NB сушили вымораживанием в течение 1,5 дней с помощью сублимационной сушилки при -55 ° C и давлении 0,080 мбар [20]. Затем лиофилизированные DOX-NB взвешивали для расчета способности загружать лекарство с точки зрения эффективности инкапсуляции лекарственного средства (EE) следующим образом:EE = A / B × 100%, где A - количество DOX, загруженное в NB, и B - начальное количество DOX в растворе. Эксперименты повторяли трижды.

Выпуск DOX, опосредованный ультразвуком

Кинетику высвобождения DOX из DOX-NB in ​​vitro определяли в присутствии и в отсутствие ультразвука (УЗИ) методом диализного мешка при 37 ° C. DOX-NB помещали в диализную мембрану (Spectra / Por, отсечка 12 000–14 000 Да), которую помещали в контейнер со 100 мл PBS при встряхивании со скоростью 100 об / мин. Группа США была обработана ультразвуком с помощью US (VCX400, Sonics and Materials, США; плотность мощности 1,0 Вт / см2; частота 20 кГц) в течение 40 с перед тестированием [21]. Высвобождение DOX измеряли в течение 24 ч, отбирая 1 мл в каждый фиксированный момент времени и заменяя 1 мл свежего PBS. Концентрации DOX во внешнем буфере измеряли при 480 нм с помощью УФ-спектрофотометра. Эксперименты по высвобождению проводились в трех экземплярах.

Ультразвуковая визуализация in vitro (кривая зависимости интенсивности от времени)

УЗИ и стабильность DOX-NB под ультразвуком были проверены in vitro на клинической системе ультразвукового сканирования (LOGIQ E9; GE, США). Эксперимент проводился с определенными частотами, мощностью передачи и продолжительностью воздействия ультразвука. Используя ранее разработанный метод [19] (рис. 5a), DOX-NB добились улучшения качества звука. Стабильность ультразвуковой визуализации DOX-NB оценивалась после воздействия на них ультразвукового стимула с механическим индексом (MI) 0,10 и глубиной визуализации 4,5 см. Все изображения США были проанализированы в автономном режиме с помощью Image J. Затем был проведен анализ изображений с использованием встроенного программного обеспечения LOGIQ E9 для расчета значений шкалы серого для образцов. Для каждого из 60-секундных клипов, которые были получены от 0 до 15 минут, сначала выполнялась коррекция движения для каждого кадра и было получено значение в децибелах. Каждое значение децибел наносили на график зависимости интенсивности от времени, чтобы отразить изменения в усилении контраста до и после ультразвукового облучения. Пиковая интенсивность и продолжительность усиления выражались кривой зависимости интенсивности от времени. В ходе анализа значения обратного рассеяния с поправкой на диапазон были получены путем вычитания фоновых сигналов, соответствующих пробе воды.

Анализ цитотоксичности для пустых NB

Биобезопасность пустых НБ хитозана проверяли с помощью набора для анализа Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Sigma-Aldrich, США). Перед анализом клетки MCF-7 высевали при плотности 2 × 10 ³ . клеток / лунку в 96-луночных планшетах. Клетки подвергали обработке различными концентрациями хитозановых НБ и ультразвуковыми условиями. Биобезопасность НБ хитозана оценивали путем инкубации клеток MCF-7 при серийных концентрациях НБ от 0 до 30%. Оборудование для ультразвуковой стимуляции низкой интенсивности (US10, Cosmogamma Corporation, Италия) использовали для выполнения ультразвуковой стимуляции с фиксированной частотой 1 МГц, используя рабочий цикл 70% и частоту импульсов 100 Гц. Каждая группа обрабатывала с разным временем облучения и разной интенсивностью звука. Из соображений безопасности использовался ультразвук с интенсивностью 0,5 Вт / см ² . или 1,0 Вт / см ² с длительностью импульса 30 или 60 с (таблица 1). Глубина, частота и другие условия ультразвука поддерживались неизменными во время всех ультразвуковых экспериментов [22]. После обработки клетки культивировали в 96-луночных планшетах в течение дополнительных 24 часов. Впоследствии поддерживающая среда, содержащая 1% FCS, была использована для замены среды, содержащей лекарственное средство, и раствор CCK-8 был добавлен в планшеты в соответствии с инструкциями производителя. После дополнительных 2,5 ч инкубации при 37 ° C спектрофотометрическое поглощение в каждой лунке определяли с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм.

Внутриклеточное потребление лекарств in vitro

Внутриклеточное поглощение DOX определяли с помощью проточной цитометрии (Beckman Coulter, Майами, США). Вкратце, клетки MCF-7 помещали в шестилуночные планшеты с плотностью 2,5 × 10 ⁵ . клеток / лунку в среде DMEM с добавлением 10% FBS. После культивирования в течение ночи среду заменяли культуральной средой, содержащей DOX-NB или свободный DOX в той же концентрации, и клетки обрабатывали ультразвуком или без него. Принимая во внимание жизнеспособность клеток и высокую эффективность сонопорации, для последующих экспериментов была выбрана концентрация DOX-NB, равная 20%, а интенсивность ультразвуковой обработки была установлена ​​на уровне 0,5 Вт / см ² с длительностью импульса 30 или 60 с. Впоследствии, после 1-часовой инкубации, клеточную среду удаляли и клетки трижды промывали свежим PBS для удаления свободных и несвязанных DOX-NB или DOX. Затем клетки собирали центрифугированием (5 мин, 1000 об / мин), ресуспендировали в 500 мкл PBS до внутриклеточного поглощения DOX и анализировали на проточном цитометре FACSCalibur. Во время анализа ворота были произвольно установлены для обнаружения красной флуоресценции, и для каждого образца было проанализировано 10 000 клеток.

Влияние DOX-NB на клетки MCF-7 in vitro

Анализ CCK-8 и проточная цитометрия использовались для количественной оценки пролиферации клеток MCF-7 и апоптоза после поглощения DOX. Вкратце, клетки MCF-7 высевали и инкубировали в 96-луночных планшетах или 6-луночных планшетах и ​​обрабатывали с использованием процедур, описанных выше. Для анализа пролиферации обработанные клетки инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов с последующим окрашиванием CCK-8 в течение 2 часов и считыванием оптической плотности на считывающем устройстве для микропланшетов. Апоптоз, индуцированный DOX, определяли с помощью анализа аннексина V-APC следующим образом:после шестичасовой обработки клетки окрашивали, добавляя 0,5 мкл V-APC (Sungene Biotech, Tianjin, China) в каждую лунку, и анализировали проточной цитометрией. (Beckman, Coulter, Fullerton, CA, USA) использовали для количественного определения апоптозных клеток.

Статистический анализ

Все эксперименты были выполнены в трех экземплярах, и данные были выражены как среднее значение. Статистический анализ проводился с использованием SPSS версии 18.0. А п значение <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Физико-химическая характеристика DOX-NB

Подготовленные НБ имели сферическую морфологию. Под инвертированным микроскопом визуализация NB показывала дискретные и неповрежденные сферические очертания (рис. 1a), что соответствовало изображениям DOX-NB под флуоресцентным микроскопом (рис. 1b). Типичное электронно-микроскопическое изображение раствора DOX-NBs показано на рис. 1c. Физические свойства NB определяли с помощью анализатора размера частиц и дзета-потенциала. Как показано на рис. 2, средний диаметр DOX-NB составлял 641 нм, P.I. 0,256. Дзета-потенциал DOX-NB составлял + 67,12 ± 2,1 мВ, что было достаточно высоким, чтобы заставить их отталкиваться друг от друга, помогая предотвратить агрегацию NB и поддерживая их долгосрочную стабильность.

NB, наблюдаемые под световым микроскопом (увеличение × 1000) ( a ) и изображение, полученное с помощью флуоресцентного микроскопа NB, нагруженных DOX ( b ) и ТЕМ-изображение NB, загруженных DOX ( c )

Распределение размеров NB, загруженных DOX

Стабильность и эффективность загрузки лекарств DOX-NB

DOX-NB были стабильны в суспензии в течение 48 часов при 4 ° C. После хранения при комнатной температуре размер DOX-NB оказался немного больше как в PBS, так и в сыворотке крови человека (рис. 3). Конечная емкость загрузки DOX-NB составила 64,12 мг DOX / г DOX-NB, что соответствует ЭЭ 54,18%.

Оптические изображения DOX-NB a при комнатной температуре, b через 6 часов при 25 ° C в PBS и c через 6 ч при 25 ° C в сыворотке

Выпуск DOX от DOX-NB в лабораторных условиях

На рисунке 4 показан профиль высвобождения DOX из DOX-NB в PBS в присутствии или в отсутствие обработки в США для оценки влияния обработки ультразвуком на высвобождение DOX. Количество DOX, высвобождаемое из DOX-NB, значительно различается между группой из США и группой за пределами США. Через 5 часов DOX-NB в группе из США высвободили 46,45% инкапсулированного DOX по сравнению с высвобождением только 9,3% в группе за пределами США. Неамериканская группа высвободила только 19,4% DOX через 24 часа. Напротив, почти 80% DOX было выброшено в группе США. Результаты показали, что ультразвуковое облучение может способствовать высвобождению DOX из DOX-NB из-за эффекта кавитации.

Высвобождение доксорубицина из DOX-NB с ультразвуковым облучением или без него (2 кГц, 1,0 Вт / см ² )

Ультразвуковая стабильность DOX-NB

DOX-NB достигали усиления ультразвука in vitro, как показано на рис. 5b. Затухание ультразвукового значения в децибелах показано на рис. 5c. Результаты показали, что DOX-NB обеспечивают хорошее усиление ультразвука, а плавная кривая демонстрирует, что процесс ослабления ультразвука в суспензиях NB был относительно медленным. Это указывает на то, что ультразвуковой сигнал DOX-NB может быть достаточно стабильным для визуализации и повышения контрастности.

Схематическое изображение экспериментальной установки in vitro ( a ), ультразвуковые изображения NB, нагруженных DOX (0, 5, 10 и 15 мин) с использованием датчика 9,0 МГц ( b ) и измерения интенсивности во времени ультразвуковых контрастных и нагруженных DOX NB ( c )

Биобезопасность пустых NB

Жизнеспособность клеток MCF-7 измеряли путем культивирования с пустыми NB (без DOX) в течение 24 часов после ультразвукового исследования. Как показано на фиг. 6, пустые NB не оказали значительного влияния на жизнеспособность клеток при определенных интенсивностях ультразвука. При использовании интенсивности ультразвука 0,5 Вт / см ² и время облучения 30 с, 99,53% и> 80% клеток MCF-7 были живыми в 10% и 30% суспензиях NBs, соответственно (группа 1), и снижение жизнеспособности клеток MCF-7 было дозозависимым. Кроме того, двумя другими факторами, влияющими на жизнеспособность клеток MCF-7, были интенсивность ультразвука и время облучения. В частности, когда концентрация пустых NB составляла 30%, клетки MCF-7, обработанные при 0,5 Вт / см ² в течение 30 с показали более высокую жизнеспособность, чем те, которые получали 0,5 Вт / см ² на 60 с или 1 Вт / см ² в течение 30 с (0,84% против 0,75% против 0,63%). Следовательно, интенсивность ультразвука 0,5 Вт / см ² и время облучения 30 с / 60 с были использованы для экспериментов по захвату клеток.

Цитотоксичность in vitro различных концентраций NB и интенсивности звука в клетках MCF-7

Улучшение доставки DOX in vitro с помощью DOX-NB и ультразвукового облучения

Клетки MCF-7, обработанные DOX-NB или свободным DOX (при равных концентрациях DOX), фиксировали, и интенсивность их флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии. Клетки, не подвергавшиеся обработке DOX, использовали в качестве холостого контроля. Поглощение DOX клетками в группе DOX-NB сравнивали с поглощением свободного DOX и контрольной группой. На рис. 7 средняя интенсивность флуоресценции клеток MCF-7, инкубированных с DOX-NB, была намного ниже, чем аутофлуоресценция клеток, инкубированных со свободным DOX, что свидетельствует о том, что инкапсуляция DOX в хитозановых NB может защитить клетки от поглощения DOX и DOX- вызванная травма.

Проточно-цитометрический анализ доставки DOX в клетки MCF-7 с помощью NB, нагруженных DOX (US1 0,5 Вт / см ² 30 с, US2 0,5 Вт / см ² 60 с)

Однако ультразвуковое облучение привело к заметному увеличению поглощения DOX клетками MCF-7, инкубируемыми с DOX-NB; DOX-NB могут доставлять больше DOX в клетки MCF-7 с помощью ультразвукового облучения. Напротив, захват DOX клетками MCF-7, инкубированными со свободным DOX, лишь незначительно увеличивался при ультразвуковом облучении. Результаты свидетельствуют о том, что поглощение DOX клетками MCF-7, инкубированными с DOX-NB, было намного выше, чем поглощение клеток, инкубированных со свободным DOX при ультразвуковом облучении.

Кроме того, поглощение DOX клетками MCF-7, инкубированными с DOX-NB, немного увеличивалось при более продолжительном времени облучения. Это может быть связано с повышенным разрывом DOX-NB, образующим временные поры на мембранах клеток MCF-7.

Повышение индуцированной DOX пролиферации опухолевых клеток и апоптоза с помощью ультразвукового облучения

Чтобы исследовать противораковые эффекты доставки DOX-NB с помощью ультразвука, жизнеспособность клеток MCF-7 измеряли с помощью анализа CCK-8 и проточной цитометрии. Результаты показывают, что жизнеспособность клеток MCF-7 в группе DOX-NB была выше, чем в группе DOX без ультразвука. Между тем, жизнеспособность клеток MCF-7 в группе DOX-NB была значительно ниже, чем в группе DOX с местным ультразвуковым облучением. Коэффициент жизнеспособности клеток в группе DOX-NBs (21,0 ± 2,2%, p <0,01) был намного выше, чем в группе, получавшей свободный DOX без ультразвукового облучения (6,4 ± 0,7%), что позволяет предположить, что в качестве векторов доставки лекарств NB улучшают вызванное DOX уменьшение пролиферации клеток в кровообращении.

Более того, коэффициент жизнеспособности клеток был значительно снижен в клетках, обработанных DOX-NB + US (3,1 ± 0,8%, 2,2 ± 0,9%), по сравнению с клетками, обработанными только DOX-NB (21,0 ± 2,2%, p <0,01), только свободный DOX (6,4 ± 0,7%) и свободный DOX + ультразвук (4,1 ± 0,8%, 3,8 ± 0,6%) (рис. 8). Данные показали, что DOX-NB + US значительно усиливали цитотоксические эффекты DOX в клетках MCF-7. Группа DOX-NBs + US также продемонстрировала большую цитотоксичность в отношении клеток MCF-7, чем группы ультразвукового исследования со свободным DOX и со свободным DOX +.

Сравнение жизнеспособности клеток в разных группах

Отношение жизнеспособности клеток в группе свободного DOX + ультразвука (4,1 ± 0,8%) было ниже, чем в группе свободного DOX (6,4 ± 0,7%). Следовательно, ультразвук также снижает жизнеспособность клеток MCF-7, обработанных свободным DOX. Коэффициент жизнеспособности клеток составлял 2,2 ± 0,9%, когда клетки обрабатывали DOX-NB + ультразвук (60 с), что было ниже, чем при обработке DOX-NB + ультразвук (30 с) (3,1 ± 0,8%), что указывает на что большая длина импульса (60 с) была более эффективной при доставке DOX-NB.

Кроме того, апоптоз клеток MCF-7 оценивали по окрашиванию аннексином V через 6 часов после обработки свободным DOX или DOX-NB с ультразвуковым облучением или без него. Процент апоптозных клеток MCF-7 в присутствии свободного DOX составлял 4,4 ± 0,9%, в то время как аналогичное соотношение наблюдалось в клетках, обработанных свободным DOX и ультразвуком (30 с, 60 с). Доставка DOX-NB с помощью ультразвука значительно увеличивала процент апоптотических клеток по сравнению с группой, получавшей свободный DOX (45,7 ± 1,1% против 4,4 ± 0,9%, p <0,01). Кроме того, процент апоптотических клеток в группе DOX-NB без ультразвукового облучения был ниже, чем в группе, получавшей свободный DOX (3,2 ± 0,9% против 4,4 ± 0,9%). Эти данные, согласующиеся с анализом жизнеспособности клеток, показали, что доставка DOX-NB с помощью ультразвука усиливает противораковый эффект DOX.