Экспериментальное исследование этосом, инкапсулированных 5-фторурацилом, в сочетании с фракционным лазером CO2 для лечения гипертрофического рубца

Фон

Гипертрофический рубец - это кожное заболевание, характеризующееся отложениями чрезмерного количества коллагена, которое вызывает приподнятый рубец, но не достигает наблюдаемой степени келоидов [1]. В развитых странах у 100 миллионов пациентов ежегодно появляются шрамы в результате 55 миллионов плановых операций и 25 миллионов операций после травм [2]. После хирургической операции примерно у 60% пациентов в послеоперационном периоде образовывались гипертрофические рубцы, обычно в течение первых 3 месяцев. Большинство гипертрофических рубцов остаются гипертрофическими через 12 месяцев после хирургических операций [3]. В настоящее время распространенные методы лечения включают хирургическое и безоперационное лечение. Давление, лучевая терапия, химиотерапия и другие медикаментозные хирургические методы лечения являются основными терапевтическими методами лечения. До сих пор эти методы лечения не могли достичь желаемого терапевтического эффекта из-за их недостатков [4, 5]. Медикаментозная терапия - одно из наиболее распространенных безоперационных методов лечения патологического рубца на внешней окраске, основанное на местных инъекциях. Из-за побочных эффектов лекарств местные инъекции часто ограничиваются лечением в малых дозах. Более того, из-за короткого периода полувыведения лекарственного средства местные инъекции лекарственного средства всегда не могли поддерживать длительную высокую концентрацию на рубце; поэтому часто требуются повторные инъекции [6]. Учитывая плотность рубцовой ткани и сильную боль, инъекции обычно не приемлемы для пациентов. Несмотря на такие преимущества, как безболезненность, отсутствие побочного действия на печень и удобство длительного наружного применения [7, 8], лекарственные средства не могли попасть в рубец из-за особой организационной структуры патологических рубцов. Недавние сообщения также показали, что лекарства для местного применения плохо проникают в рубцовую ткань [9]. Таким образом, наружное использование препарата в настоящее время ограничено.

Этосомы - новый липидный носитель, использованный Touitou в 2000 году [10], эффективный для доставки лекарств через кожу. Основным компонентом этосом является этанол, который может изменять плотное расположение липидных молекул кутикулы, повышать текучесть липидов и способствовать гибкости и подвижности липосомных мембран этанола. Этанол из этосом также может ускорять деформацию рогового слоя и увеличивать его способность переносить и проникать лекарственным средством через поврежденный роговой слой кожи [11,12,13]. Однако в отличие от нормальной кожной ткани рубцовая ткань имеет особую структуру. В нашем предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что этосомы являются высокоэффективным носителем лекарства в рубцах человека [14]. Необходимо, чтобы лекарственное средство в рубцовой ткани не распределялось должным образом, а было значительно уменьшено снаружи внутрь кожи. Препарат в основном накапливается в эпидермисе и поверхностном слое дермы, но не во всех слоях дермы, что снижает эффект против рубцевания.

Абляционная фракционная лазерная терапия, косметическая технология, очень популярна и широко применяется в настоящее время и в основном используется для клинического лечения мимических морщин, поверхностных рубцов, нарушений пигментации и улучшения текстуры кожи [15,16,17]. Основанный на теории матричного фототермолиза [18], абляционный фракционный лазер создает массив крошечных лазерных лучей и разрушает кожный барьер, создавая абляционные микроскопические вертикальные каналы, окруженные зоной термического повреждения, вызывая реакцию заживления ран на умеренной коже. внешний вид [19,20,21,22]. Сообщалось, что основным препятствием для чрескожного всасывания лекарств является роговой слой [23, 24]. Недавние исследования показали, что один из наиболее часто используемых в клинических условиях абляционных фракционных лазеров CO ₂ фракционный лазер может разрушать роговой слой и образовывать плотные микропористые каналы, тем самым подрывая основной барьер, препятствующий чрескожной абсорбции лекарства и обеспечивая хорошее трансдермальное проникновение лекарства, способствуя его проникновению [25,26,27,28].

В этом исследовании мы исследовали CO ₂ фракционный опосредованный лазером этосомальный гель, несущий лекарственное средство против рубцевания 5-фторурацил (5-FU) в образцах человеческих рубцов и на модели гипертрофического рубца уха кролика. Используя этот новый подход, мы сосредоточились на повышении эффективности приема лекарств от рубцов, чтобы сократить длительный процесс лечения рубцов. Впервые для определения CO ₂ была применена модель гипертрофического рубца уха кролика. фракционные наноразмерные этосомы, опосредованные лазером, несущие 5-ФУ на гипертрофические рубцы и эффект проникновения лекарственного средства. Вместе было предложено, чтобы CO ₂ фракционный лазер в сочетании с лекарствами для местного применения представляет собой новый метод лечения гипертрофического рубца у человека.

Методы

Этосомы, инкапсулированные с 5-ФУ

Метод Туиту [10] был использован для приготовления этосом, инкапсулированных с 5-ФУ. Распределение частиц по размерам при 25 ° C и индекс полидисперсности (PDI) определяли с использованием лазерного анализатора размера частиц ( λ =632,8 нм). PDI <0,1 указывает на равномерное распределение частиц по размерам, а PDI> 0,3 указывает на неоднородное распределение частиц по размерам. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) использовалась для наблюдения за морфологией этосом. В этом исследовании для измерения эффективности инкапсуляции (ЭЭ) этосом использовался метод ультрацентрифугирования [29].

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Концентрацию 5-ФУ в рецепторном отделении клеток Франца определяли с помощью системы HPLC Waters 2695 (Meadows Instrumentation, Illinois) и ультрафиолетового детектора 2487 с обращенно-фазовой колонкой Diamonsil TM C18 (250 мм × 4,6 мм, 5 мкм ). 5-ФУ был обнаружен при 265 нм с подвижной фазой метанол – H ₂ О (5:95 v / v ) при скорости потока 1 мл / мин. Данные были проанализированы по площади пика и методом внешнего стандарта с использованием Waters Empower System.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

Гипертрофическую рубцовую ткань человека анализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) с шагом 10 мкм. Интенсивность флуоресценции анализировали с использованием лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 (Zeiss, Jena, Germany) с объективом Fluar 10 ×, 0,5 с числовой апертурой. Оптическое возбуждение осуществляли с помощью гелий-неонового лазера с длиной волны 543 нм, и флуоресцентное излучение было обнаружено выше 560 нм для родамина 6GO (Rho). Изображения были проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа изображений Release Version 4.0 SP2 для расчета распределения флуоресценции и интенсивности флуоресценции рубцовых тканей. В 10 × 10-кратном поле зрения размер и распределение значений пикселей должны были определить диапазон проникновения 5-FU EG (помеченный Rho) полуколичественным методом.

Анализ проницаемости этосом 5-ФУ в ткани рубца человека

Образцы гипертрофических рубцов человека из Девятой народной больницы пластической хирургии Шанхайского университета Цзяотун получены в результате иссечения рубцов у трех пациентов, все женщины в возрасте 21–35 лет; рубец располагается на плече и спине; течение гипертрофического рубца от 6 месяцев до 1 года; целостность рубцовой ткани; нет изъязвлений; отсутствие инфекционных поражений; и самый нижний рубец также должен быть выше кожи, и с момента болезни пациент не получал никакого лечения. Для устранения воздействия местных анестетиков на рубцовую ткань применялась общая анестезия. Полученные образцы немедленно удаляли из подкожной клетчатки, защищали эпидермис, делали толщиной 4,0 мм, на площади 3 см × 3 см образцы рубцовой ткани, промывали физиологическим раствором при комнатной температуре, сушили марлей сухой поверхностной влажностью, заворачивали с алюминиевой фольгой и хранить в холодильнике при -20 ° C. Гипертрофическую рубцовую ткань человека удаляли и хранили в морозильной камере при -20 ° C перед использованием. Гипертрофическую рубцовую ткань человека погружали в PBS с pH 7,4 при 25 ° C на 2 часа и осторожно удаляли воду с поверхности ткани сухой марлей. Все области эпидермальной ткани гипертрофированной рубцовой ткани были CO ₂ фракционное лазерное облучение. За параметрами лазера сразу следуют режим DeepFX, плотность энергии 25 мДж, покрытие 20%, частота излучения 300 Гц, размер пятна 10 и без перекрытия. Все облученные образцы собирали с помощью ВЭЖХ для определения содержания 5-ФУ в рубцовой ткани. Гистопатологические срезы немедленно используются для анализа CLSM.

Модель гипертрофического шрама уха кролика

Метод модели гипертрофического рубца уха кролика был кратко описан ниже:12 новозеландских белых кроликов, самцы, весом 2 кг (SLAC, Шанхай) содержались отдельно в течение 2 недель. Для анестезии кролика люмианнинг смешивали с 1,5 мг кетамина на 100 г веса посредством внутримышечной инъекции. Все раны были окружены центральной точкой кроличьих ушей. Каждая круглая рана диаметром 1 см была дефектной, затем надхрящницу удалили. Через двадцать восемь дней после операции корка уха кролика отделилась от раны и полностью зажила, с видимым диаметром около 0,9 см гипертрофические рубцы. Шрам был ярко-красным, на коже вокруг очевидной гиперплазии образовывались бугорки, а шрам был толстым и твердым.

Определение скорости открытия микроканалов

Различные моменты времени после CO ₂ фракционное лазерное лечение на модели гипертрофического рубца уха кролика, на ткани рубца была нанесена красная флуоресценция Роданмин 6GO с этосомами. Через три часа CLSM использовался для определения скорости открытия канала. Скорость открытия канала =номер открытого канала / (номер открытого канала + номер закрытого канала) × 100%. Процент скорости открытия канала отражает влияние CO ₂ эффективность фракционного лазерного проникновения.

Окрашивание H&E

Обычно кроликов умерщвляют с использованием 10% пентобарбитала внутривенно. для инъекций (доза, в 5 раз превышающая нормальную дозу для анестезии, 35 мг / кг). Немедленно удалите образцы и перейдите к этапу окрашивания H&E. Метод окрашивания гематоксилином и эозином соответствует стандартному протоколу окрашивания H&E.

Индекс высоты рубца и определение относительной толщины

Через двадцать восемь дней после индукции гипертрофических рубцов уха кролика выполняются четыре группы вмешательств:группа 5EL:энтосомные гели, инкапсулированные 5-FU в сочетании с CO ₂ фракционный лазер; Группа 5E:энтосомные гели, инкапсулированные 5-FU; CO ₂ группа:CO ₂ фракционное лазерное лечение; и контрольная группа. Мы определили A как толщину самой толстой части гипертрофической рубцовой ткани уха кролика, а B как толщину 1,0 см от самой толстой части гипертрофической рубцовой ткани уха кролика (близко к центральной точке). Относительная толщина рассчитывается как A / B. Гипертрофия кожных рубцов была проиллюстрирована SEI. SEI =площадь новообразованной дермы / площадь неповрежденной дермы. SEI> 1,5 - гипертрофический рубец.

Статика

Все эксперименты повторяли трижды. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводился с использованием SPSS версии 19.0 (SPSS Inc., Чикаго, США). Студенческий t тест использовался для расчета значимости. * p значение <0,05 считалось статистически значимым; ** p значение <0,01 считалось статистически значимым; *** p значение <0,001 считалось статистически чрезвычайно значимым, а **** p значение <0,0001 считалось статистически чрезвычайно значимым.

Результаты

Оценка качества этосом, инкапсулированных с 5-флороурацилом (5E)

Прежде всего, для проверки качества этосомального геля, инкапсулированного 5-фторурацилом (5E), морфология и диаметр были обнаружены с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ). Этосомы в суспендированном состоянии образовывали полный круг универсального размера или овально-сферическую везикулу, которая под микроскопом составляет менее 100 нм (рис. 1а – б). После приготовления геля этосомы остались нетронутыми (рис. 1c – d). При использовании лазерного анализатора размера частиц этосомы в состоянии суспензии имели диаметр 87,72 ± 9,27 нм, а PDI составлял 0,10 ± 0,01. Между тем размер частиц этосом составлял 98,78 ± 10,88 нм, а PDI составлял 0,11 ± 0,02. Статическое сравнение показывает, что размер частиц не имеет существенной разницы ( p > 0,05). Кроме того, оба PDI не имели существенной разницы ( p > 0,05). Кроме того, данные, полученные с помощью лазерного анализатора размера частиц и ПЭМ, показали сопоставимые результаты. Кроме того, эффективность захвата (EE) также определялась с использованием метода ультрацентрифугирования (таблица 1). Результаты показали, что ЭЭ этосомной суспензии составлял 10,47 ± 1,47%, а ЭЭ этосомного геля составлял 11,56 ± 1,12% ( n =6), без значения ( p > 0,05). В заключение следует отметить, что никаких изменений морфологии и размера частиц в суспензионном и гелеобразном состоянии этосом обнаружено не было.

Изображения этосом 5-ФУ, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Этосомы решений ( a и b ) и этосомы геля ( c и d )

CO ₂ Фракционный лазер способствует проницаемости 5E через гипертрофические рубцы in vitro

После оценки качества этосом, инкапсулированных 5-фторурацилом (5-FU), мы исследовали его проницаемость в гипертрофических рубцах человека с CO ₂ или без него. фракционный лазер in vitro . Гипертрофическая рубцовая ткань человека была облучена CO ₂ фракционный лазер, а затем 5E равномерно применялся. Кумулятивные концентрации 5-ФУ определяли через 1, 3, 6, 10, 16 и 24 часа с помощью ВЭЖХ (2). Мы сравнили кумулятивные концентрации CO ₂ в 5-FU. фракционный лазер в сочетании с этосомами, инкапсулированными с группой 5-фторурацила (5EL) и группой 5E в разные моменты времени. Через 1 час кумулятивная концентрация 5-ФУ в группе 5EL составила 4,15 ± 2,22 мкг / мл / см ² . , что было выше, чем концентрация группы 5E (0,73 ± 0,33 мкг / мл / см ² , p <0,001). При длительном лечении (24 ч) кумулятивная концентрация проницаемости 5-ФУ в группе 5EL (107,61 ± 13,27 мкг / мл / см ² ) также был выше, чем в группе 5E (20,73 ± 3,77 мкг / мл / см ² , p <0,0001). В более ранние временные точки, 3, 6, 10 и 16 часов, группы 5EL всегда демонстрировали более высокую кумулятивную концентрацию проникновения 5-FU, чем группы 5E (рис. 2a). Более того, удерживаемое количество 5-ФУ в группе 5EL составляло 24,42 ± 4,37 мкг / см ² . , что выше, чем у группы 5E (12,45 ± 1,64 мкг / см ² , p <0,01, n =6) (рис. 2б). Этот результат предполагает, что CO ₂ фракционное лазерное облучение может значительно продвинуть липосомы, содержащие 5-ФУ, через гипертрофическую рубцовую ткань человека и помочь удержанию 5-ФУ в гипертрофической рубцовой ткани in vitro.

CO ₂ фракционный лазер способствует проницаемости 5E через гипертрофические рубцы in vitro . а Сравнение проникновения групп 5E и 5EL в 24-часовом исследовании гипертрофического рубца человека in vitro. Значения были выражены как среднее ± стандартное отклонение. нет =6. b Накопленная задержка 5-ФУ в гипертрофическом рубце in vitro после нанесения в течение 24 часов. нет =6. *** p значение <0,001 считалось статистически чрезвычайно значимым, **** p значение <0,0001 считалось статистически чрезвычайно значимым

Глубина и степень проникновения 5-FU были определены с использованием 5E, помеченного Rho, чтобы оценить усиливающий эффект проникновения CO ₂ фракционный лазер in vitro. Флуоресцентный анализ использовали для определения интенсивности групп 5E и 5EL через 1, 6 и 24 часа после обработки 5-FU (рис. 3a). Результаты показали, что после 1-часовой обработки 5EL флуоресценция Rho распределялась в поверхностном слое эпидермиса и дермы, особенно вокруг CO ₂ зона фракционной лазерной газификации. Напротив, без CO ₂ фракционное лазерное облучение, распределение флуоресценции Rho ограничивалось областью эпидермиса в группе 5E. После 6-часовой обработки в группе 5EL флуоресценция Rho расширилась до глубоких слоев дермы и продемонстрировала большее накопление. Хотя распределение флуоресценции группы 5E начало проявляться в дерме, интенсивность флуоресценции постепенно снижалась от дермы к эпидермису. После 24-часовой обработки флуоресценция двух групп широко распределялась по всей ткани кожи, но интенсивность флуоресценции в группе 5EL была значительно выше. Кроме того, программное обеспечение для анализа изображений версии 4.0 SP2 использовалось для количественного анализа для расчета интенсивности флуоресценции для обеих групп. Результаты количественного анализа показали значительное увеличение интенсивности флуоресценции Rho в группе 5EL, чем в группе 5E (1 час:59,61 ± 6,39 против 6,39 ± 1,64, p <0,0001; 6 ч:163,32 ± 13,23 против 49,89 ± 4,01, p <0,0001; 24 ч:270,36 ± 8,73 мс. 148,25 ± 16,89, p <0,0001) (рис. 3б). Таким образом, CO ₂ фракционное лазерное облучение значительно способствует проникновению 5E в гипертрофическую рубцовую ткань человека in vitro.

CO ₂ фракционный лазер способствует проницаемости гипертрофических рубцов in vitro . а Красная флуоресценция маркирует этосомы, пронизывающие гипертрофические рубцовые ткани через 1, 6 и 24 часа in vitro. б Интенсивность флуоресценции этосом, меченных родамином 6GO, на гипертрофированной рубцовой ткани in vitro через 1, 6 и 24 часа. **** p значение <0,0001 считалось статистически чрезвычайно значимым

Продолжительность CO ₂ Фракционный лазер увеличивает проникновение 5-ФУ in vivo

Чтобы получить более веские доказательства CO ₂ фракционный лазерный эффект, мы выполнили проникновение 5-ФУ in vivo на модели гипертрофического рубца кролика. Настройка модели гипертрофического рубца кролика была описана как Метод. Различные моменты времени (3 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 3 дня и 7 дней) после нанесения CO ₂ Был проведен фракционный лазер, обработка 5E или 5EL, и сразу же было определено распределение флуоресценции с помощью CLSM (рис. 4). Флуоресценция Rho была широко видима и широко распространена в слое дермы гипертрофических рубцов уха кролика, которые были ближе к абляционной зоне (рис. 4а). Эти результаты могут указывать на то, что Rho, смешанный с 5E, в основном проникает через пористый канал после CO ₂ фракционное лазерное облучение. Флуоресценцию можно обнаружить в зоне абляции, окружающей ткань дермы, через 6 ч 5EL, даже при небольшой площади распространения (рис. 4b). Область распространения флуоресценции продолжает сокращаться через 12 часов после лечения препаратом, что указывает на постепенное закрытие микропористых каналов по мере заживления раны (рис. 4в). Через 24 часа, 3 дня и 7 дней лечения CO ₂ При фракционном лазерном облучении флуоресценция может быть обнаружена только в порах корки вокруг отверстий и не проникает в дерму (рис. 4d – f), что предполагает, что CO ₂ Эффект фракционного лазерного проникновения исчез при полной реэпителизации эпидермиса. Наши данные свидетельствуют о том, что открытие микроканалов играет решающую роль в проникновении лекарств при лечении 5EL. После этого мы рассчитали скорость открытия микроканалов через 3 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 3 дня и 7 дней после лазерного облучения, соответственно. В моменты времени 3 и 6 ч все микропористые каналы были открыты, что указывало на то, что скорость открытия микроканалов составляла 100%. Скорость открытия микроканалов начала снижаться до 90,59% через 12 часов и 15,58% через 24 часа. В частности, все микропористые каналы были закрыты через 3 и 7 дней после обработки 5EL. Взятые вместе, эти результаты показывают, что CO ₂ фракционный лазер контролирует проникновение лекарства в гипертрофическую рубцовую ткань кролика in vivo.

CO ₂ фракционный лазер увеличивает скорость открытия микроканалов in vivo. Красная флуоресценция отмечена, что этосомы проникают в гипертрофические рубцовые ткани уха кролика 0 ч ( a ), 6 ч ( b ), 12 ч. ( c ), 24 ч ( д ), 3 дня ( e ) и 7 дней ( f ) после CO ₂ фракционное лазерное лечение in vivo

Терапевтический эффект 5EL на гипертрофический рубец in vivo

Чтобы глубже понять лечение 5EL, мы провели определение относительной толщины гипертрофического рубца уха кролика. После установки модели гипертрофического рубца уха кролика были рассчитаны значения относительной толщины до и после лечения 5EL. Не было обнаружено значительных различий в группах до лечения. Однако относительная толщина группы 5EL составила 1,27 ± 0,15, что было значительно ниже, чем у группы 5E (1,52 ± 0,10, p <0,05) и без обработки (1,61 ± 0,15, p <0,0001) группы (рис.5). Интересно, что значительных изменений между CO ₂ не произошло. только группа лазерного лечения и группа 5EL. Эти данные показывают, что CO ₂ фракционный лазер играет доминирующую роль в лечении гипертрофического рубца уха кролика in vivo.

Сравнение относительной толщины гипертрофических рубцов кроликов до и после применения различных методов лечения. 5EL:энтосомные гели, инкапсулированные 5-FU в сочетании с CO ₂ фракционный лазер, n =14; CO ₂ :CO ₂ только фракционный лазер, n =12; Группа 5E:энтосомные гели, инкапсулированные 5-FU, n =14; control:пусто, n =16. * p значение <0,001 считалось значимым, **** p значение <0,0001 считалось статистически чрезвычайно значимым

Мы также сравнили морфологию гипертрофического рубца уха кролика, чтобы определить разницу при использовании CO ₂ фракционный лазер. В группе 5EL гипертрофические рубцы стали более плоскими, и цвет значительно стал светло-розовым (рис. 6a – b). В CO ₂ В группе только с фракционным лазерным лечением толщина гипертрофического рубца в некоторой степени уменьшилась и его цвет стал бледно-красным (рис. 6c – d). В группе 5E толщина гипертрофического рубца немного уменьшилась, но цвет остался ярко-красным (рис. 6e – f). Наконец, не было значительных изменений в группе, не получавшей лечения, по сравнению с группой до лечения (рис. 6g – h). Затем окрашивание H&E использовали для патологического анализа через 7 дней после обработки этих четырех групп на гипертрофированной рубцовой ткани ушей кролика (рис. 7). Группа 5EL и CO ₂ В группах только с фракционным лазерным лечением было показано уменьшение толщины кожного слоя гипертрофических рубцов и точечной корки с редкими поверхностными волокнами коллагена дермы, узловатыми или спиралевидными (рис. 7a – b). Большое количество проникновений дермальных коллагеновых волокон, неупорядоченное расположение коллагеновых волокон и узловое или спиралевидное расположение поверхностной дермы были обнаружены в группе 5E и необработанной группе (рис. 7c-d). Другой важный метод оценки гипертрофического рубца - это индекс возвышения рубца (SEI). Аналогично структуре относительной толщины, SEI группы 5EL (1,16 ± 0,08) и CO ₂ Группа только фракционного лазерного лечения (1,22 ± 0,10) была значительно снижена по сравнению с группой 5E (1,32 ± 0,13) и необработанной группой (1,49 ± 0,08) (рис. 8). Взятые вместе, данные морфологического анализа и расчета SEI показывают CO ₂ фракционный лазер воздействует на заживление гипертрофического рубца уха кролика in vivo.

Фотоснимки гипертрофических шрамов кроликов до и после различных процедур в течение 7 дней. Группа 5EL:энтосомные гели, инкапсулированные 5-FU в сочетании с CO ₂ фракционный лазер, до ( a ) и после ( b ) курс лечения 7 дней; CO ₂ группа:CO ₂ фракционный лазер, до ( c ) и после ( d ) курс лечения 7 дней; 5E группа B:энтосомные гели, инкапсулированные 5-FU, до ( e ) и после ( f ) курс лечения 7 дней; и пустая группа:пустая, перед ( g ) и после ( h ) курс лечения 7 дней

H&E гистологический анализ гипертрофических рубцов кроликов после применения различных процедур в течение 7 дней. Группа 5EL:энтосомные гели, инкапсулированные 5-FU в сочетании с CO ₂ фракционный лазер ( а ); CO ₂ группа:CO ₂ фракционное лазерное лечение ( b ); Группа 5E:энтосомные гели, инкапсулированные 5-FU ( c ); и пустая группа:пустая ( d ). Оригинальное увеличение:× 40

Сравнение SEI гипертрофических рубцов кроликов после применения различных методов лечения в течение 7 дней. 5EL:энтосомные гели, инкапсулированные 5-FU в сочетании с CO ₂ фракционный лазер, n =14; CO ₂ :CO ₂ фракционный лазер, n =12; 5E:энтосомные гели, инкапсулированные 5-FU, n =14; control:пусто, n =16. *** p значение <0,001 считалось статистически чрезвычайно значимым и **** p значение <0,0001 считалось статистически чрезвычайно значимым

Обсуждение

Медикаментозное лечение является основным методом лечения гипертрофических рубцов, в основном местным или в виде местных инъекций. Из-за побочных эффектов различных лекарств местная инъекция часто ограничивается небольшими дозами и, таким образом, допускает лишь небольшой диапазон лечения. Также из-за короткого периода полувыведения лекарств, стойкие высокие концентрации в рубцах требуют повторных инъекций [6, 30, 31]. Кроме того, из-за того, что рубцовая ткань очень сконцентрирована и при сильной боли во время инъекций нередко пациенты не принимают ее для лечения. Although external drug usage having advantage of being convenient, painless, with long-term stability, low side effects, avoiding to affection of the gastrointestinal environment [7, 8], there are several limitations. First of all, topical and injected drugs availability is limited by special pathological scar tissue structure, which presents with a thickening of the stratum corneum and hyperplasia of the dermis, which hinders the penetration of the drug and achieving an effective therapeutic concentration. Recent reports have proven this and described how external use of drugs inefficiently penetrates the scar tissue [4, 9]. Ethosomes, proposed by Touitou et al. [10] in 2000 as a transdermal drug carrier, have been widely reported [11, 12, 32]. In this study, we improved the ethosomes preparation process to nano-level (particle size 70~90 nm). This change of a new nanoscale dimensions and the spatial conformation of the ethosomes allow them to penetrate into the scar tissue through a narrowly tightly connected cell gap not only due to the small size, but also by the similarity to the cell membrane of scar tissue cells. Based on such penetration mechanisms, ethosomes become a convenient transdermal drug carrier [14, 33, 34]. However, the anti-scar drug 5-FU encapsulated with ethosomes is mainly concentrated in the epidermis and dermis, which is not conducive to fibroblasts in deeper layers of the dermis. Therefore, our purpose is to explore a method that would allow to increase the penetration of drugs and would promote the uniform dispersion of drugs in scar tissue.

So far, commonly used methods to promote the penetration are divided into two categories:the promotion of chemical substances and physical methods to enhance permeability. The physical enhancement techniques include electroporation, iontophoresis, laser, microdermabrasion, microneedle, pressure, radiofrequency induction, and sonography [35]. There are many different types of lasers that have been shown to promote percutaneous administration, and ablative fractional lasers become the most popular laser in recent years for promoting drug penetration into the skin [20]. Ablative fractional laser can not only extremely reduce drug dosage, but also be conducive to drug penetration into deep skin and achieve high local concentrations to obtain a therapeutic effect. CO₂ fractional laser, Erbium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Er:YAG) fractional laser, and Erbium-doped Yttrium Scandiu Gallium Garnet (Er:YSGG) fractional laser can produce ablative zone or microporous channels on the surface of the skin. Compared with Er:YAG fractional laser (2940 nm wavelength) and Er:YSGG fractional laser (2790 nm wavelength), CO₂ fractional laser (10,600 nm wavelength) has lower water absorption coefficient, larger thermal damage, and greater destruction effect of stratum corneum of the epidermis, which is more conducive to promote penetration effect [36].

In this study, 5-FU retention in the 5EL group (24.42 ± 4.37 μg / cm ² ) was significantly higher than in the 5E group (12.45 ± 1.64 μg/cm ² ) in scar tissue of 24 h treatment in vitro. Additionally, in Rho-labeled assay, 5EL group has shown higher fluorescence intensity than 5E group at 1-, 6-, and 24-h treatment time points. Image analysis showed that fluorescence can be found distributed in the gasification zone and surrounding dermal tissue matrix after 1-h CO₂ laser treatment in the 5EL group, and the fluorescence in 5E group is only distributed in the epidermis. After 6- and 24-h treatment, diffuse fluorescence range is wider and fluorescence intensity is higher in the 5EL group than in the 5E group. CO₂ fractional laser-induced gasification zone provided an effective way for drug penetration through the skin scar tissue, enlarge range of dermis penetration depth, and retention content in scar tissue. There are three different forms of thermal effect damage by CO₂ fractional laser acting on the skin or scar tissue, from center to outliner, the gasification zone, thermal coagulation necrosis zone, and thermal denaturation zone [37]. Fluorescence data showed that Rho fluorescence was distributed from more concentrated gasification zone to diffused tissue, suggesting that there is no effect for permeation of drugs in thermal coagulation necrosis zone and thermal denaturation zone, which also confirmed the feasibility of CO₂ fractional laser for the promotion of topical anti-scarring drug penetration. Together, CO₂ fractional laser is conducive to more anti-scarring drugs 5-FU retention in scar tissue and achieve high drug concentration required to strengthen the anti-scarring effect.

The duration of CO₂ fractional laser enhancing 5E was evaluated by CLSM on rabbit ear hypertrophic scar in vivo. The opening rates of microporous channels for drug permeation were 100% (0 h), 100% (6 h), 90.59% (12 h), and decreased to 15.58% (24 h) after CO₂ fractional laser treatment of hypertrophic scar. Moreover, microporous channel opening rates dropped to zero on 3 and 7 days, and the drug can no longer penetrate into the skin through these channels. These results were consistent with that of epidermal re-epithelialization after ablative fractional laser irradiation, which is the skin wound around the keratinocytes to the wound defect migration and proliferation, covering the wound to form a complete layer of cells formed by the epidermis. When the dermal layer of skin was wound, the repair process will immediately start and quickly rebuild the skin barrier [38, 39]. The whole skin tissue trauma repair process can be divided into four continuous and overlapping steps:coagulation, inflammation, re-epithelialization, and remodeling [40]. Human skin after ablation of the fractional laser irradiation injury area (including the gasification area and coagulation necrosis area) complete epidermal re-epithelialization in 2 to 3 days and dermal remodeling for at least 4 weeks [41]. Thus, although the lesion in the dermis does not heal within 24 h after the CO₂ laser treatment, the epidermis has completed the complex epithelization, including the formation of the stratum corneum, where the topical drug could not penetrate through channels. Taken together, epidermis, especially the stratum corneum, is still the main barrier for drug penetration through the skin.

In addition, our CLSM data showed both in in vitro human hypertrophic scar skin and in vivo rabbit ear hypertrophic scar skin, Rho-labeled 5E can penetrate the necrotic coagulation layer and the formation of crust on the surface after the CO₂ fractional laser irradiation. It suggested that the skin under the crust but not the coagulation necrotic layer and crust tissue can impede the penetration of drug. Therefore, 24 h is the critical time-point for the effect of CO₂ fractional laser on the penetration effect of hypertrophic scar in rabbits.

It has been reported that the clinical application of exfoliative fractional laser is an effective method to treat various skin diseases (such as solar keratosis, basal cell carcinoma, Bowen’s disease, etc.) [25,26,27,28]. However, the clinical efficacy of CO₂ fractional laser in combination with drugs has not been explored in the treatment of hypertrophic scars [42, 43]; in particular, there are no reports of combined CO₂ fractional laser (physical technique) with anti-scar drug nano-level ethosomes (chemical substances promoting scar penetration) for the treatment of hypertrophic scars. Using in vivo study, we performed a rabbit hypertrophic scar model for validation of CO₂ fractional laser protocol. On the seventh day after intervention, the relative thickness of the four groups of hypertrophic scar was measured:experimental group (CO₂ fractional laser combined with 5-FU EG):1.27 ± 0.15 2 fractional laser irradiation only):1.35 ± 0.09 2 fractional laser had a leading role in the intervention of hypertrophic scars. This finding was mainly manifested in three aspects. First of all, CO₂ fractional laser generated micro-channels for the promotion of scar drugs penetration. Secondly, CO₂ fractional laser itself could help in hypertrophic scar tissue’s collagen remodeling. Thirdly, 5E itself could directly influence hypertrophic scars. From H&E staining data, we found that processes of collagen fiber bundle remodeling, from disordered, different-direction collagen fibers into a consistent, paralleled direction collagen beam take place. In the experimental group of rabbit ear hypertrophic scar, there was a significant reduction in scar thickness, but also color change of hypertrophic scar, from bright red to light red, which may be induced by vascular proliferation of the scar tissue.

The toxicity of the ethosomes should be a big concern in this study. Nevertheless, after reviewing literature, there are no results exhibiting the toxicity of ethosomes in vitro or in vivo study [44,45,46]. The permeability mechanism of ethosomes is mainly as follows:high concentration of ethosomes, the flexibility, and fluidity of ethanol liposome membrane, makes ethosomes deform in the process of transmission, and enhances the permeability in scar tissue [47].

Although the difference between the experiment group and control group A was not statistically significant, the relative thickness and SEI of the experimental group was smaller than that in the control group A. Both groups were treated with CO₂ fractional laser, with or without 5E. This finding suggests that CO₂ fractional laser may have the dominant role, which overtakes the minor effect of 5E drug in the final anti-scar effect.

Conclusion

CO₂ fractional laser can rapidly and significantly promote 5-fluorouracil encapsulated ethosomes’ permeability through hypertrophic scars in vitro. CO₂ fractional laser is a potentially efficient method of promoting drug permeation in hypertrophic scars’ treatment. Our hypertrophic scar model (rabbit) showed that CO₂ fractional laser combined with external-loaded 5-fluorouracil encapsulated ethosomes can effectively cure hypertrophic scars. Also, CO₂ fractional laser itself can facilitate collagen remodeling in hypertrophic scar of rabbit ears. CO₂ fractional laser can significantly promote the permeation of 5-fluorouracil encapsulated ethosomes, but the effect begins to relinquish 24 h after CO₂ fractional laser irradiation, which indicates that 24 h is a critical period.