Инсулин

<час />

Фон

Инсулин - это гормон, который регулирует количество глюкозы (сахара) в крови и необходим для нормального функционирования организма. Инсулин вырабатывается клетками поджелудочной железы, называемыми островками Лангерганса. Эти клетки постоянно выделяют небольшое количество инсулина в организм, но они выделяют выбросы гормона в ответ на повышение уровня глюкозы в крови.

Определенные клетки в организме превращают потребляемую пищу в энергию или глюкозу в крови, которую клетки могут использовать. Каждый раз, когда человек ест, уровень глюкозы в крови повышается. Повышенный уровень глюкозы в крови заставляет клетки островков Лангерганса выделять необходимое количество инсулина. Инсулин позволяет переносить глюкозу из крови в клетки. Клетки имеют внешнюю стенку, называемую мембраной, которая контролирует то, что входит в клетку и выходит из нее. Исследователи еще не знают точно, как работает инсулин, но они знают, что инсулин связывается с рецепторами на мембране клетки. Это активирует набор транспортных молекул, так что глюкоза и белки могут проникать в клетку. Затем клетки могут использовать глюкозу в качестве энергии для выполнения своих функций. После попадания в клетку уровень глюкозы в крови возвращается к норме в течение нескольких часов.

Без инсулина уровень глюкозы в крови накапливается в крови, и клетки лишаются источника энергии. Некоторые из симптомов, которые могут возникнуть, включают усталость, постоянные инфекции, помутнение зрения, онемение, покалывание в руках или ногах, повышенную жажду и замедленное заживление синяков или порезов. Клетки начнут использовать жир, источник энергии, запасенный на случай чрезвычайных ситуаций. Когда это происходит слишком долго, организм вырабатывает кетоны, химические вещества, вырабатываемые печенью. Кетоны могут отравлять и убивать клетки, если они накапливаются в организме в течение длительного периода времени. Это может привести к тяжелому заболеванию и коме.

Люди, у которых не вырабатывается необходимое количество инсулина, страдают диабетом. Есть два основных типа диабета. Самый тяжелый тип, известный как диабет I типа или ювенильный диабет, - это когда организм не вырабатывает инсулин. Больные диабетом I типа обычно вводят себе различные типы инсулина от трех до четырех раз в день. Дозировка принимается на основе показаний глюкозы крови человека, взятых из глюкометра. У диабетиков II типа вырабатывается некоторое количество инсулина, но его либо недостаточно, либо их клетки не реагируют нормально на инсулин. Обычно это происходит у людей с ожирением, среднего и пожилого возраста. Больным диабетом II типа не обязательно принимать инсулин, но они могут вводить инсулин один или два раза в день.

Существует четыре основных типа инсулина, которые производятся в зависимости от того, как скоро инсулин начинает действовать, когда он достигает пика и как долго он сохраняется в организме. По данным Американской диабетической ассоциации, инсулин быстрого действия попадает в кровь в течение 15 минут, достигает пика через 30-90 минут и может сохраняться в течение пяти часов. Инсулин короткого действия попадает в кровь в течение 30 минут, достигает пика примерно через два-четыре часа и остается в крови в течение четырех-восьми часов. Инсулин средней продолжительности действия попадает в кровь через 2-6 часов после инъекции, достигает пика через 4-14 часов и может сохраняться в крови в течение 14-20 часов. И инсулину длительного действия требуется от 6 до 14 часов, чтобы начать действовать, вскоре после этого он имеет небольшой пик и остается в крови в течение 20-24 часов. У всех диабетиков разные реакции на инсулин и потребности в нем, поэтому не существует одного типа, который лучше всего подходит для всех. Некоторые виды инсулина продаются в одном флаконе, смешанном с двумя типами.

История

Если организм не вырабатывает инсулин в достаточном количестве или не производит его, людям необходимо принимать его промышленную версию. Основное применение производства инсулина для диабетиков, которые не вырабатывают достаточное количество инсулина естественным путем.

До того, как исследователи обнаружили, как вырабатывать инсулин, у людей, страдающих диабетом I типа, не было шансов на здоровую жизнь. Затем в 1921 году канадские ученые Фредерик Г. Бантинг и Чарльз Х. Бест успешно очистили инсулин из поджелудочной железы собаки. На протяжении многих лет ученые постоянно совершенствовали производство инсулина. В 1936 году исследователи нашли способ производить инсулин с более медленным высвобождением в кровь. Они добавили протеин, содержащийся в сперме рыб, протамин, который медленно расщепляется организмом. Одна инъекция длилась 36 часов. Еще один прорыв произошел в 1950 году, когда исследователи создали инсулин, который действует немного быстрее и не остается в кровотоке так долго. В 1970-х годах исследователи начали пытаться произвести инсулин, который больше имитировал действие естественного инсулина организма:высвобождение небольшого количества инсулина в течение всего дня с резкими скачками, происходящими во время еды.

Исследователи продолжали улучшать инсулин, но основной метод производства оставался неизменным на протяжении десятилетий. Инсулин экстрагировали из поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней и очищали. Химическая структура инсулина у этих животных лишь немного отличается от человеческого инсулина, поэтому он так хорошо функционирует в организме человека. (Хотя у некоторых людей была отрицательная иммунная система или аллергические реакции.) Затем, в начале 1980-х годов, биотехнология произвела революцию в синтезе инсулина. Исследователи расшифровали химическую структуру инсулина еще в середине 1950-х годов. Вскоре они определили точное местоположение гена инсулина на вершине хромосомы 11. К 1977 году группа исследователей встроила ген инсулина крысы в ​​бактерию, которая затем вырабатывала инсулин.

Фредерик Бонтинг.

В 1891 году в Аллистоне, Онтарио, родился Фредерик Бантинг. В 1916 году он окончил медицинский факультет Университета Торонто. После службы в Медицинском корпусе во время Первой мировой войны Бантинг заинтересовался диабетом и изучал болезнь в Университете Западного Онтарио.

В 1919 году Мозес Бэррон, исследователь из Университета Миннесоты, показал, что закупорка протока, соединяющего две основные части поджелудочной железы, вызывает усыхание второго типа клеток, ацинар. Бантинг считал, что, перевязав проток поджелудочной железы для разрушения ацинарных клеток, он может сохранить гормон и извлечь его из островковых клеток. Бантинг предложил это главе отделения физиологии Университета Торонто Джону Маклауду. Маклауд отклонил предложение Бантинга, но предоставил помещения для лаборатории, 10 собак и студента-медика Чарльза Беста

Начиная с мая 1921 года, Бантинг и Бест перерезали протоки поджелудочной железы у собак, чтобы ацинарные клетки атрофировались, а затем удалили поджелудочную железу, чтобы извлечь жидкость из островковых клеток. Тем временем они удалили поджелудочные железы у других собак, чтобы вызвать диабет, а затем ввели жидкость островковых клеток. В январе 1922 года 14-летний Леонард Томпсон стал первым человеком, которого успешно вылечили от диабета с помощью инсулина.

Бест получил степень доктора медицины в 1925 году. Бантинг настоял на том, чтобы Бест тоже был зачислен, и чуть не отказался от его Нобелевской премии, потому что Бест не был включен. Бест стал главой факультета физиологии Университета Торонто в 1929 году и директором университетского отдела медицинских исследований Бантинг и Бест после смерти Бантинга в 1941 году.

В 1980-х годах исследователи использовали генную инженерию для производства человеческого инсулина. В 1982 году Eli Lilly Corporation произвела человеческий инсулин, который стал первым одобренным фармацевтическим продуктом, созданным с помощью генной инженерии. Не полагаясь на животных, исследователи могли производить генно-инженерный инсулин в неограниченных количествах. Он также не содержал никаких загрязнителей животного происхождения. Использование человеческого инсулина также сняло любые опасения по поводу передачи любых потенциальных болезней животных на инсулин. В то время как компании по-прежнему продают небольшое количество инсулина, полученного от животных, в основном свиней, с 1980-х годов, пользователи инсулина все чаще переходят на форму человеческого инсулина, созданную с помощью технологии рекомбинантной ДНК. По данным Eli Lilly Corporation, в 2001 году 95% пользователей инсулина в большинстве регионов мира принимали человеческий инсулин в той или иной форме. Некоторые компании полностью прекратили производство инсулина животного происхождения. Компании сосредотачиваются на синтезе человеческого инсулина и аналогов инсулина, что в некотором роде является модификацией молекулы инсулина.

Сырье

Человеческий инсулин выращивают в лаборатории среди обычных бактерий. кишечная палочка на сегодняшний день является наиболее широко используемым типом бактерий, но также используются дрожжи.

Исследователям нужен человеческий белок, производящий инсулин. Производители получают это с помощью машины для секвенирования аминокислот, которая синтезирует ДНК. Производители знают точный порядок аминокислот инсулина (молекул на основе азота, которые образуют белки). Есть 20 распространенных аминокислот. Производители вводят аминокислоты инсулина, а секвенатор соединяет аминокислоты вместе. Также для синтеза инсулина необходимы большие резервуары для роста бактерий, а для роста бактерий необходимы питательные вещества. Для разделения и очистки ДНК необходимы несколько инструментов, таких как центрифуга, а также различные инструменты для хроматографии и рентгеновской кристаллографии.

Производственный
процесс

Синтез человеческого инсулина - это многоступенчатый биохимический процесс, который зависит от основных методов рекомбинантной ДНК и понимания гена инсулина. ДНК несет в себе инструкции о том, как работает организм, и один небольшой сегмент ДНК, ген инсулина, кодирует белок инсулин. Производители манипулируют биологическим предшественником инсулина так, чтобы он рос внутри простых бактерий. Хотя у каждого производителя есть свои вариации, существует два основных метода производства человеческого инсулина.

Работа с человеческим инсулином

• 1 Ген инсулина - это белок, состоящий из двух отдельных цепочек аминокислот, A над цепью B, которые удерживаются вместе связями. Аминокислоты - это базовые единицы, из которых строятся все белки. Цепь А инсулина состоит из 21 аминокислоты, а цепь В - из 30.
• 2 Прежде чем стать активным белком инсулина, инсулин сначала вырабатывается в виде препроинсулина. Это одна длинная белковая цепь с еще не разделенными цепями А и В, участок в середине, связывающий цепи вместе, и сигнальная последовательность на одном конце, сообщающая белку, когда начинать секретирование вне клетки. После препроинсулина цепь превращается в проинсулин, все еще одну цепь, но без сигнальной последовательности. Затем идет активный белок инсулин, белок без участка, соединяющего цепи A и B. На каждом этапе белку нужны определенные ферменты (белки, которые проводят химические реакции) для производства следующей формы инсулина.

НАЧИНАЯ С А И Б

• 3 Один из методов производства инсулина - выращивание двух инсулиновых цепей по отдельности. Это позволит избежать производства каждого из необходимых ферментов. Производителям нужны два мини-гена:один, который производит цепь A, а другой - цепь B. Поскольку точная последовательность ДНК каждой цепи известна, они синтезируют ДНК каждого мини-гена в машине для определения последовательности аминокислот.
• 4 Эти две молекулы ДНК затем вставляются в плазмиды, небольшие кольцевые фрагменты ДНК, которые легче захватываются ДНК хозяина.
• 5 Производители сначала вставляют плазмиды в безопасный тип бактерии E. coli. Они вставляют его рядом с lacZ ген. LacZ кодирует 8-галактозидазу, ген, широко используемый в процедурах рекомбинантной ДНК, потому что его легко найти и разрезать, что позволяет легко удалить инсулин, чтобы он не терялся в ДНК бактерии. Рядом с этим геном находится аминокислота метионин, которая запускает образование белка.
• 6 Рекомбинантные вновь образованные плазмиды смешиваются с бактериальными клетками. Плазмиды попадают в бактерии в процессе, называемом трансфекцией. Производители могут добавлять к клеткам ДНК-лигазу, фермент, который действует как клей, помогая плазмиде прилипать к ДНК бактерии.
• 7 Бактерии, синтезирующие инсулин, затем подвергаются процессу ферментации. Их выращивают при оптимальных температурах в больших резервуарах на заводах-производителях. Миллионы бактерий воспроизводятся примерно каждые 20 минут посредством митоза клеток, и каждая из них экспрессирует ген инсулина.
• 8 После размножения клетки вынимают из резервуаров и вскрывают, чтобы извлечь ДНК. Один из распространенных способов сделать это - сначала добавить смесь лизозом, которая переваривает внешний слой клеточной стенки, а затем добавить смесь детергентов, которая отделяет мембрану жировой клеточной стенки. Затем ДНК бактерии обрабатывают цианогенбромидом, реагентом, который расщепляет белковые цепи по остаткам метионина. Это отделяет цепи инсулина от остальной ДНК.
• 9 Две цепи затем смешиваются вместе и соединяются дисульфидными связями посредством реакции восстановления-повторного окисления. Добавляется окислитель (материал, вызывающий окисление или перенос электрона). Затем партия помещается в центрифугу - механическое устройство, которое быстро вращается для разделения компонентов клеток по размеру и плотности.
• 10 Затем смесь ДНК очищают, так что остаются только цепи инсулина. Производители могут очищать смесь с помощью нескольких методов хроматографии или разделения, которые используют различия в заряде, размере и сродстве молекулы к воде. Используемые процедуры включают ионообменную колонку, высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой и колонку для гель-фильтрации. Производители могут тестировать партии инсулина, чтобы убедиться в отсутствии бактерий E. coli белки смешиваются с инсулином. Они используют белок-маркер, который позволяет им обнаруживать E. coli ДНК. Затем они могут определить, что в процессе очистки удаляются E. coli бактерии.

ПРОИНСУЛИНОВЫЙ ПРОЦЕСС

• 11 Начиная с 1986 года производители начали использовать другой метод синтеза человеческого инсулина. Они начали с проинсулина, прямого предшественника гена инсулина. Многие этапы такие же, как при производстве инсулина с цепями A и B, за исключением того, что в этом методе аминокислотный аппарат синтезирует ген проинсулина.
• 12 Последовательность, кодирующая проинсулин, вставлена ​​в непатогенную E. coli бактерии. Бактерии проходят процесс ферментации, где они воспроизводятся и производят проинсулин. Затем соединительная последовательность между цепями А и В сращивается с помощью фермента, и полученный инсулин очищается.
• 13 В конце производственного процесса к инсулину добавляются ингредиенты, чтобы предотвратить появление бактерий и помочь сохранить нейтральный баланс между кислотами и основаниями. К инсулину среднего и длительного действия также добавляют ингредиенты для получения инсулина желаемого типа с длительным сроком действия. Это традиционный метод производства инсулина длительного действия. Производители добавляют в очищенный инсулин ингредиенты, продлевающие его действие, например оксид цинка. Эти добавки задерживают всасывание в организме. Добавки различаются между разными марками инсулина одного и того же типа.

Аналоговый инсулин

В середине 1990-х исследователи начали улучшать работу человеческого инсулина в организме, изменив его аминокислотную последовательность и создав аналог - химическое вещество, которое имитирует другое вещество достаточно хорошо, чтобы обмануть клетку. Аналоговый инсулин меньше скапливается и легче растворяется в крови, позволяя инсулину начать работать в организме через несколько минут после инъекции. Есть несколько разных аналогов инсулина. Хумулин-инсулин не имеет прочных связей с другим инсулином и поэтому быстро всасывается. Другой аналог инсулина, называемый Glargine, изменяет химическую структуру белка, чтобы обеспечить его относительно постоянное высвобождение в течение 24 часов без выраженных пиков.

Вместо того, чтобы синтезировать точную последовательность ДНК для инсулина, производители синтезируют ген инсулина, последовательность которого слегка изменена. Изменение вызывает в результате Схема этапов производства инсулина. белки отталкиваются друг от друга, что снижает слипание. Процесс производства с использованием этой измененной последовательности ДНК аналогичен описанному процессу рекомбинантной ДНК.

Контроль качества

После синтеза человеческого инсулина структура и чистота партий инсулина проверяются несколькими различными методами. Для определения наличия примесей в инсулине используется высокоэффективная жидкостная хроматография. Также выполняются другие методы разделения, такие как рентгеновская кристаллография, гель-фильтрация и аминокислотное секвенирование. Производители также проверяют упаковку флакона, чтобы убедиться, что она запечатана должным образом.

Производство человеческого инсулина должно соответствовать процедурам Национального института здравоохранения для крупномасштабных операций. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США должно утверждать весь производимый инсулин.

Будущее

У инсулина будущего много возможностей. Поскольку инсулин был впервые синтезирован, диабетикам необходимо было регулярно вводить жидкий инсулин с помощью шприца непосредственно в кровоток. Это позволяет инсулину немедленно попадать в кровь. В течение многих лет это был единственный известный способ переместить неповрежденный белок инсулина в организм. В 1990-х годах исследователи начали заниматься синтезом различных устройств и форм инсулина, которые диабетики могут использовать в альтернативной системе доставки лекарств.

Производители в настоящее время производят несколько относительно новых устройств для доставки лекарств. Инсулиновые ручки выглядят как ручка для письма. Картридж содержит инсулин, а наконечник - игла. Пользователь устанавливает дозу, вводит иглу в кожу и нажимает кнопку, чтобы ввести инсулин. С ручками нет необходимости использовать флакон с инсулином. Однако в ручки необходимо вставлять отдельные наконечники перед каждой инъекцией. Еще одним недостатком является то, что ручка не позволяет пользователям смешивать типы инсулина, и не весь инсулин доступен.

Для людей, ненавидящих иглы, альтернативой ручке является струйный инжектор. Похоже на ручки, форсунки используют давление, чтобы продвигать крошечный поток инсулина через кожу. Эти устройства не так широко используются, как ручка, и могут вызвать синяки в точке ввода.

Инсулиновая помпа обеспечивает контролируемое высвобождение в организме. Это компьютеризированная помпа размером с пейджер, которую диабетики могут носить на поясе или в кармане. Помпа имеет небольшую гибкую трубку, которая вставляется прямо под поверхность кожи диабетика. Диабетик настраивает помпу на постоянную дозировку инсулина в течение дня, увеличивая ее непосредственно перед едой. Это имитирует нормальное высвобождение инсулина организмом. Производители производят инсулиновые помпы с 1980-х годов, но достижения конца 1990-х и начала двадцать первого века сделали их все более простыми в использовании и более популярными. Исследователи изучают возможность имплантации инсулиновых помп. Диабетики могут управлять этими устройствами с помощью внешнего пульта дистанционного управления.

Исследователи изучают другие варианты доставки лекарств. Одна из возможностей - проглатывание инсулина в таблетках. Проблема со съедобным инсулином заключается в том, что кислая среда желудка разрушает белок, прежде чем он попадет в кровь. Исследователи работают над покрытием инсулина пластиком толщиной в несколько человеческих волос. Покрытия защитят лекарства от желудочной кислоты.

В 2001 году проводятся многообещающие испытания устройств для ингаляции инсулина, и производители могут начать производство этих продуктов в течение следующих нескольких лет. Поскольку инсулин представляет собой относительно большой белок, он не проникает в легкие. Исследователи вдыхаемого инсулина работают над созданием частиц инсулина, достаточно маленьких, чтобы достичь глубоких слоев легких. Затем частицы могут попасть в кровоток. Исследователи тестируют несколько ингаляционных устройств, похожих на ингалятор от астмы.

Другая форма аэрозольного устройства, подвергаемого испытаниям, будет вводить инсулин во внутреннюю щеку. Известный как буккальный (щечный) инсулин, диабетики распыляют инсулин на внутреннюю поверхность щеки. Затем он всасывается через внутреннюю стенку щеки.

Пластыри с инсулином - еще одна разрабатываемая система доставки лекарств. Пластыри будут непрерывно выделять инсулин в кровоток. Пользователи потянули за пластырь, чтобы высвободить больше инсулина перед едой. Проблема состоит в том, чтобы найти способ прохождения инсулина через кожу. Ультразвук - это один из методов, который исследуют исследователи. Эти низкочастотные звуковые волны могут изменять проницаемость кожи и пропускать инсулин.

Другие исследования могут избавить производителей от необходимости синтезировать инсулин. Исследователи работают над созданием клеток, производящих инсулин в лаборатории. Идея состоит в том, что когда-нибудь врачи смогут заменить неработающие клетки поджелудочной железы клетками, производящими инсулин. Еще одна надежда для диабетиков - генная терапия. Ученые работают над исправлением мутации гена инсулина, чтобы диабетики могли самостоятельно вырабатывать инсулин.

Где узнать больше

Книги

Кларк, Дэвид П. и Лонни Д. Рассел. Молекулярная биология стала простой и увлекательной. 2-е изд. Вена, Иллинойс:Cache River Press, 2000.

Консидайн, Дуглас М., изд. Научная энциклопедия Ван Ностранда. 8-е изд. Нью-Йорк:International Thomson Publishing Inc., 1995.

Периодические издания

Динсмур, Роберт С. «Инсулин:бесконечная эволюция». Обратный отсчет (Весна 2001 г.).

Другое

Веб-страница "Диабетического дайджеста". 15 ноября 2001 г. .

Открытие веб-страницы инсулина. 16 ноября 2001 г. .

Eli Lilly Corporation. Хумулин и Хумалог Девелопмент. CD-ROM, 2001 г.

Диабетическая веб-страница Эли Лилли. 16 ноября 2001 г. .

Диабетическая веб-страница Ново Нордиск. 15 ноября 2001 г. .

М. Рэй Нельсон