Функционализированные липосомы против Epcam Aptamer (Syl3c) для адресной доставки доксорубицина:противоопухолевые исследования in vitro и in vivo на мышах, несущих карциному толстой кишки C26

Введение

Системы доставки наночастиц (NDDS) размером 100–200 нм пассивно накапливаются в микросреде опухоли за счет эффекта повышенной проницаемости и удерживания (EPR). Это происходит из-за рыхлой эндотелиальной выстилки и слабого лимфодренажа. Однако недавние данные показали, что только менее 1% введенного лекарства может попасть в место опухоли [1]. Отсутствие способности проникать в плотный внеклеточный матрикс (ВКМ) опухоли, возврат высвободившегося препарата в кровоток и гетерогенность опухолей являются причинами, ответственными за эту неудачу [2]. Для улучшения накопления NDDS в опухоли использовались различные стратегии с использованием эндогенных и экзогенных стимулов [3]. Эти NDDS могут реагировать на экзогенные стимулы, такие как свет, и могут использоваться при визуализации опухолей [4]. Существует множество различных неорганических наноматериалов, которые можно использовать в качестве противораковых агентов [5, 6]. Однако в случае неорганических наноматериалов следует обращать внимание на их токсичность и безопасность для окружающей среды [7,8,9,10,11].

Активная адресная доставка - важный подход, который помогает NDDS доставлять терапевтические агенты более эффективно к опухолям и сводить к минимуму воздействие на ткани, не являющиеся мишенями [12, 13]. Идеальным нацеливающим агентом для направленной доставки является молекула, которая имеет сродство к белкам или рецепторам клеточной поверхности, активируемым конкретными клетками или компонентами ткани [14].

Молекула адгезии эпителиальных клеток (EpCAM) представляет собой трансмембранный гликопротеин, который рассматривается в качестве лиганда-кандидата для активного нацеливания. Недавние открытия показали, что EpCAM имеет нормальную низкую экспрессию в здоровых эпителиальных клетках, тогда как в раковых клетках его экспрессия становится на более высоком уровне (до 1000 раз) [15,16,17]. Во время развития рака характер экспрессии EpCAM изменяется от базальной и базолатеральной мембран в нормальном эпителии к апикальной поверхности в эпителиальных клетках опухоли [18]. Эта дифференциальная экспрессия делает EpCAM очень интересным лигандом для доставки лекарств, который может улучшить терапевтический индекс лекарства [19].

EpCAM демонстрируется как маркер раковых стволовых клеток (CSC) или опухолевых инициирующих клеток (TIC), экспрессия которых при раке связана с плохим прогнозом [20]. CSC или TIC - это клетки, которые обладают самообновлением, способностью производить больше клеток одного и того же типа, которые играют ключевую роль в развитии опухоли и метастазировании [21]. Сообщалось о сверхэкспрессии EpCAM в РСК различных солидных опухолей [22]. В последнее время аптамеры привлекли большое внимание в широком диапазоне исследований и стали потенциально мощными молекулами, которые можно использовать в NDDS в качестве нацеливающего лиганда [23, 24]. Аптамеры представляют собой последовательности олигонуклеотидов на основе ДНК или РНК, которые обладают вторичными и третичными структурами, имеющими сродство к своим мишеням, таким как рецепторы клеточной поверхности [23, 24]. Аптамеры также имеют несколько преимуществ перед, например, они неиммуногенны, имеют низкую молекулярную массу (8-25 кДа), химическую и термическую стабильность. Кроме того, их синтез и химические модификации дешевы и масштабируемы [25]. Избирательное нацеливание на NDDS с помощью анти-EpCAM-специфического аптамера можно рассматривать как эффективный вариант нацеливания для доставки химиотерапевтических агентов в микроокружение опухоли [19, 26]. В этой связи различные исследования показали, что функционализированные наноносители аптамера против EpCAM могут эффективно улучшать доставку противоопухолевых препаратов к опухолевым клеткам [15, 27, 28].

Целью данного исследования является разработка ДНК-аптамера против EpCAM (SYL3C) -PEG -илированных нанолипосом, нагруженных доксорубицином (DOX) (ED-lip), в качестве модели NDDS. Такую функционализацию проводили с помощью химии сочетания EDC / NHS между аминогруппой аптамера и карбоксильной группой DSPE-mPEG ₂₀₀₀ , который пост-вставляется в липосому, как показано на фиг. 1. ED-губа, характеризующаяся размером, дзета-потенциалом и процентом инкапсуляции доксорубицина, профилем высвобождения и цитотоксичностью. Затем мы оценили, могут ли эти ED-lip улучшать захват клеток in vitro и доставлять DOX в опухоль с помощью нацеливания у мышей с опухолями карциномы толстой кишки C26.

Приготовление функционализированного против EpCAM Caelyx® (ED-lip). а Связывание аптамера против EpCAM с DSPE-mPEG ₂₀₀₀ посредством ковалентного связывания первичных аминов (-NH2) аптамера против EpCAM с карбоксильной группой (-COOH) DSPE-mPEG ₂₀₀₀ . б Метод после введения для приготовления функционализированного против EpCAM Caelyx® (ED-lip)

Результат и обсуждение

Caelyx®, ПЭГилированный липосомальный доксорубицин, является одним из наиболее широко используемых химиотерапевтических агентов и первой одобренной FDA наночастицей, которая показана для лечения рака яичников, связанной со СПИДом саркомы Капоши и множественной миеломы. Caelyx® пассивно проникал в место опухоли за счет эффекта ЭПР [29]. Хотя Caelyx® значительно улучшает фармакокинетику и период полувыведения DOX; однако основными ограничениями Caelyx® являются недостаточное клеточное поглощение и низкая скорость высвобождения лекарства в месте опухоли [29]. Здесь мы использовали аптамер SYL3C в качестве нацеливающего лиганда для функционализации липосомального доксорубицина (ED-lip) для нацеливания молекулы EpCAM на поверхность раковых клеток, что позволяет доставлять DOX к конкретному целевому сайту в процессе активного нацеливания.>

Конъюгация DSPE-mPEG ₂₀₀₀ в Аптамер

В настоящем исследовании мы использовали химию связывания EDC / NHS для конъюгации функционализированных амином аптамеров анти-EpCAM с активной карбоксильной группой DSPE-mPEG ₂₀₀₀ -COOH. Преимущество этой реакции сочетания с использованием химии сочетания EDC / NHS и образования амидной связи заключается в ее стабильности и снижении неспецифических взаимодействий между аптамерами [30]. Аптамеры можно модифицировать первичной аминогруппой или тиоловой группой и ковалентно конъюгировать для активации карбоксильной или пиррольной группы малеимида соответственно [31]. Аптамеры, модифицированные тиоловой группой, конъюгировали с функциональной группой малеимида DSPE-PEG ₂₀₀₀ . Затем DSPE-PEG ₂₀₀₀ -аптамер пост-вставляется в структуру липосомы для декорирования внешней поверхности липосом [32]. Одним из важных ограничений химии малеимидных тиолов является то, что во время хранения тиоловая группа аптамеров может подвергаться окислению, что приводит к образованию дисульфидной связи (S-S) между двумя аптамерами, модифицированными тиолом. Эти димерные аптамеры не могут участвовать в реакции конъюгации с функциональной группой малеимида DSPE-PEG ₂₀₀₀ [30]. Следовательно, использование реакций EDC / NHS увеличивает выход продукта и улучшает метод после введения.

Аптамер имеет некоторые преимущества перед антителами, включая простоту синтеза и масштабирования, низкую системную токсичность и отсутствие иммуногенности [33]. Здесь, после конъюгации аптамера с липидом, был задействован метод пост-инсерции, чтобы сделать декорированный аптамером против EpCAM Caelyx® (ED-lip). Как правило, пост-инсерционная техника представляет собой простой и эффективный метод прикрепления аптамеров к поверхности липосом, обеспечивающий более высокую скорость включения аптамеров в липосомы [34].

Мы использовали анализ сдвига подвижности с помощью гель-электрофореза для оценки пост-вставки аптамера против EpCAM на липосомы. Как показано на фиг. 2, отрицательно заряженные аптамеры мигрировали в геле, и наблюдалась их полоса, в то время как для композиции ED-lip не было никакой полосы-аналога, потому что ED-lip застрял в линии лунок и не мог перемещаться через гель. Эти результаты показали, что мицеллы, конъюгированные с аптамерами, были успешно вставлены на поверхность липосом.

Электрофорез состава ED-lip в агарозном геле. Образцы загружают в агарозный гель. УФ-свет визуализировал гель. Обозначены лунки, соответствующие лестнице, свободному аптамеру и аптамеру, конъюгированным с PL. Отсутствие соответствующей полосы в липосоме-аптамере указывает на подтверждение после вставки

Физико-химическая характеристика ED-губы

Физико-химические характеристики Caelyx® и ED-lip показаны в таблице 1. Размер и заряд приготовленных составов показали, что модификация Caelyx® аптамером против EpCAM не оказала значительного влияния на размер частиц ( p > 0,05). Размер липосом до введения аптамера (Caelyx®) составлял около 96 нм с PDI 0,11, после пост-вставки (ED-lip) размер липосом частично увеличился до 117 нм с PDI 0,14, которые имеют желаемый размер для доставки в опухоль. Результаты предыдущих исследований также показали, что включение нацеливающих лигандов приводит к увеличению размера и PDI липосом [35, 36]. Более того, дзета-потенциал ED-губы (-19,25) стал более отрицательным, чем у Caelyx® (-12). Было показано, что конъюгация РНК-аптамер в липосому приводит к снижению дзета-потенциала липосомы [37]. Увеличение размера и отрицательный дзета-потенциал ED-губы может свидетельствовать об успешном пост-введении конъюгированных аптамеров на поверхность липосом [38]. Эти результаты согласуются с нашим предыдущим исследованием, которое показало, что прикрепление аптамера к поверхности Caelyx® приводит к небольшому увеличению размера частиц и более отрицательному дзета-потенциалу в функционализированном аптамером Caelyx® [38, 39]. Однако эффективность пост-вставки следует тестировать с точки зрения времени инкубации и температуры, чтобы получить более эффективные пост-вставленные липосомы с лучшим размером и PDI. Эффективность инкапсуляции Caelyx® и ED-lip составила 100% (см. Таблицу 1).

Количество аптамера, пост-вставленного на поверхность липосомы, определяли, как описано [6]. Общее количество фосфолипидов липосомального состава, определенное с помощью анализа фосфатов, составляло 14 мМ. Так как среднее количество липидных молекул в липосомах со средним размером 100 нм составляет 8 × 10 ⁴ количество липосом в каждом миллилитре составляет почти 10 ¹⁴ [38]. Молекулярная масса аптамера составляла г / моль. Количество DSPE-mPEG ₂₀₀₀ -аптамер определяли на основе методов анализа фосфата, в которых моли фосфатных молекул соответствуют молям конъюгированных молекул. На основании этих данных количество молекул аптамера на каждую аликвоту раствора составляет 10 ¹⁵ . .

Профиль выпуска DOX

Введение конъюгированных с аптамером мицелл на внешнюю поверхность Caelyx® может повлиять на профиль высвобождения DOX. Поэтому мы оценили высвобождение DOX-формы ED-lip по сравнению с Caelyx® в 5% декстрозе с 50% FBS. Эта среда может имитировать высвобождение препаратов в плазме [40]. На рисунке 3 показано, что нет существенной разницы в высвобождении DOX из композиций Caelyx® и ED-lip в течение 24 часов исследования, и было высвобождено только незначительное количество DOX. Это согласуется с нашими предыдущими исследованиями, которые показали, что внедрение аптамера на поверхность липосом не влияет на стабильность мембраны и профиль высвобождения DOX [38, 39]. Это в основном связано со стабильностью состава Caelyx®, который был составлен с использованием метода удаленной загрузки, управляемого градиентом pH [41].

Релиз исследование. Профиль утечки содержания DOX из Caelyx® и ED-lip при 37 ° C в присутствии 50% FBS в декстрозе в течение 24 часов исследования. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SEM) ( n =3)

Взаимодействие клеток и поглощение клеток с помощью флуоресцентной микроскопии

Взаимодействие клеток и поглощение клетками липосомальных составов оценивали при 4 ° C и 37 ° C, что показано на фиг. 4. Оценка эффективности воздействия ED-lip показала, что не было различий между средней интенсивностью флуоресценции (MFI). клеток CHO-K1, обработанных Caelyx® и ED-lip при 4 ° C и 37 ° C (рис. 4a, c). Однако данные продемонстрировали, что целевая ED-губа значительно выше поглощалась клетками C26 по сравнению с Caelyx® при 4 ° и 37 ° C (рис. 4b, d), что было статистически значимым при 37 ° C ( p <0,0001). ED-lip имеет значительное поглощение по сравнению с Caelyx® ( p <0,001). Эти результаты показали, что ED-губа, повышенная специфичность мишени за счет аптамера против EpCAM, имеет большее сродство к линии клеток C26 по сравнению с клетками CHO-K1. Свободный DOX свободно проходит через липидный бислой и проникает в клетку, поэтому имеет самое высокое поглощение клетками среди композиций и, следовательно, имеет самую высокую цитотоксичность. В случае Caelyx® ПЭГилирование ограничивает скорость эндоцитоза и приводит к снижению цитотоксичности. Однако присутствие аптамера против EpCAM на поверхности липосом (ED-lip) увеличивает скорость интернализации препарата в клетки и увеличивает его цитотоксичность по сравнению с Caelyx® [38]. Данные флуоресцентной микроскопии показали, что разница между клеточным поглощением ED-lip и свободного DOX в клеточной линии C26 при 37 ° C не была значимой (рис. 5). Однако масштабирование на основе интенсивности интернализованного DOX показано в таблице 2, в которой ED-lip и DOX показали статистически значимые различия с Caelyx® в поглощении клетками C26 ( p <0,001). Хотя клетки C26 экспрессируют низкий уровень EpCAM на своей поверхности [42], данные этого исследования позволяют предположить, что присутствие аптамера против EpCAM может увеличить скорость процесса интернализации липосом [43].

Взаимодействие клеток и поглощение клетками липосомальных составов оценивали при 4 ° C и 37 ° C. а Взаимодействие композиций с клетками CHO-K1 при 4 ° C и 37 ° C. б Взаимодействие составов с клетками C26 при 4 ° C и 37 ° C. c График демонстрирует средний MFI составов на клетках CHO-K1 и C26. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SEM) ( n =3). **** p <0,0001

Люминесцентная микроскопия. Результаты интернализации DOX клетками на линиях клеток C26 визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки окрашивали DAPI. И свободный DOX, и ED-lip имеют более высокий уровень интернализации DOX по сравнению с Caelyx®. Клетки обследованы под увеличением × 200

Исследование цитотоксичности

Эффекты цитотоксичности композиций со свободным DOX, Caelyx® и ED-lip показаны на фиг. 6. Различные концентрации препаратов использовали для обработки клеток в течение 1, 3 и 6 часов и оставляли для инкубации в течение следующих 72 часов. Данные продемонстрировали, что все препараты действуют на клетки во времени и в зависимости от дозы. Жизнеспособность клеток C26, обработанных составом ED-lip, снизилась по сравнению с клетками, обработанными Caelyx®. Поскольку клетки CHO-K1, как EpCAM-отрицательные клетки, демонстрируют более низкий ответ на ED-lip по сравнению с клетками C26, похоже, что аптамер против EpCAM увеличивает специфическую доставку Caelyx® к клеткам-мишеням. Эти результаты могут подтвердить специфический клеточный захват ED-lip клетками C26. Эти результаты подчеркивают важность использования адресной доставки лекарств со специфическими нацеливающими агентами для избирательной доставки лекарства к клеткам-мишеням с уменьшением побочных эффектов лекарства за счет предотвращения попадания в цель [44]. Как сообщалось ранее, активное нацеливание Caelyx® со специфическими нацеливающими лигандами, такими как аптамер и антитело, приводит к усилению активного нацеливания на опухоль и специфической доставки лекарств к клеткам-мишеням, что, в свою очередь, увеличивает терапевтическую эффективность DOX [35, 39].

Эффект цитотоксичности in vitro (IC50) ED-lip, Caelyx® и свободного доксорубицина в отношении клеток CHO и клеток C26 после разного времени воздействия. Данные представлены в мкг / мл ± стандартное отклонение (SEM) ( n =3). * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001

Биораспределение и фармакокинетика

Чтобы оценить, как аптамер против EpCAM влияет на биораспределение DOX, мы вводили дозу 10 мг / кг ED-lip и Caelyx® мышам с подкожными опухолями рака толстой кишки C26. Концентрация DOX в плазме через 3, 12, 24, 48 и 72 часа после инъекции Caelyx® и ED-lip показана на рис. 7. Результаты показывают, что поведение концентраций DOX в плазме в обеих группах было сходным, и не было никаких существенных различий между обоими составами. Как показано в таблице 3, конъюгация аптамера против EpCAM с липосомальной поверхностью немного уменьшала полупериод циркуляции с 39,3 до 34,2 часа и MRT с 47,6 до 42,9 часа (см. Таблицу 3). Фармакокинетические параметры показали, что конъюгация аптамера против EpCAM на липосомах немного снижает t _½ и MRT, которые согласовывались с предыдущими сообщениями, продемонстрировали, что конъюгация аптамера на липосомальной поверхности ускоряет клиренс липосом [38]. Адсорбция белка и последующее удаление его мононуклеарной фагоцитарной системой (MPS) может быть причиной ускорения клиренса из крови наночастиц, конъюгированных с лигандом [45].

Уровень DOX в плазме. Результаты зависимости концентрации от времени количества DOX в крови через 3, 12, 24, 48 и 72 часа после инъекции. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SEM) ( n =3)

Как показано на фиг. 8, сравнивали концентрации DOX в основных собранных органах в группах, получавших Caelyx® и ED-lip. Наиболее важным побочным действием свободного DOX является кардиотоксичность, благодаря которой Caelyx® значительно снижает риск этого побочного эффекта [46]. Биораспределение ED-губы в печени, легких и селезенке значительно выше, чем у Caelyx® при времени 3 часа. Наличие протекающих кровеносных сосудов и увеличение размера и PDI ED-губы после вставки могут быть причинами большего накопления ED-губы в этих тканях в более раннее время. Было показано, что увеличение размера наночастиц до 150 нм увеличивает накопление наночастиц в печени, легких и селезенке [47]. Между тем, результаты исследования биораспределения четко показывают механизм ЭПР в накоплении наночастиц в опухоли. На рисунке 8 четко показано, что и ED-lip, и Caelyx® постепенно накапливаются в месте опухоли и достигают максимума примерно через 12 часов, остаются на плато до 24 часов, а затем постепенно уменьшаются через 48 и 72 часа. Интересен во всех временных точках 3, 12, 24, 48 и 72 часа; Накопление ED-lip в опухоли значительно больше, чем у Caelyx®, что может быть связано с эффективностью активного нацеливания с аптамером против EpCAM. Эти результаты показали, что прикрепление аптамера к поверхностной дозе липосом не влияет на распределение DOX в почках. Следовательно, кажется, что аптамеры против EpCAM эффективно способствуют специфическому для опухоли проникновению липосом, что также может быть связано со сверхэкспрессией молекул EpCAM в эндотелиальных клетках сосудов опухоли [48]. Ранее было показано, что аптамеры против EpCAM могут увеличивать проникновение опухоли в опухоли ксенотрансплантата [49]. CSC или TIC также являются мишенью терапии против EpCAM. Введение аптамеров против EpCAM в качестве нацеливающего лиганда для нацеливания на EpCAM показало многообещающие эффекты при нацеливании на CSC [22, 50]. Здесь можно предположить, что часть эффективного противоопухолевого эффекта ED-lip может быть связана с успешным нацеливанием на ОСК.

Биораспределение тканей. Результаты биораспределения DOX в сердце, опухолях, печени, легочной селезенке и почках. Концентрации (мкг / г) сообщаются через 3, 12, 24, 48 и 72 часа после инъекции для каждого органа. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SEM) ( n =3). * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001

Противоопухолевое действие in vivo

Терапевтическая эффективность ED-lip оценивалась на модели опухоли карциномы толстой кишки C26. Размер опухоли, массу тела и выживаемость контролировали в течение почти 2 месяцев, и результаты суммированы на рис. 9 и в таблице 4. Данные показывают, что ED-lip не оказывает очевидного влияния на массу тела мышей, как и Caelyx® (см. Рис. 9a. ). Как показано на фиг. 9b, после внутривенной инъекции Caelyx® и ED-lip скорость роста опухоли эффективно ингибируется вплоть до 30 дня после инъекции, и нет существенной разницы в липосомальных группах. Через 30 дней после инъекции скорость роста опухоли увеличивалась, однако скорость роста в группах, получавших лекарства, была все еще ниже, чем в группе, получавшей PBS. Разница между группой Caelyx® и ED-lip не была значимой в течение 30 дней после инъекции. Результаты выживаемости представлены на графике Каплана – Мейера. На рисунке 9c показана кривая улучшения выживаемости ED-lip по сравнению с PBS или Caelyx®. Основные показатели исследования выживаемости были сведены в Таблицу 4. Опухоли у трех мышей из группы ED-lip были полностью излечены, поэтому MST для этой группы не определен. Лечение ED-lip увеличивало TTE с 41,1 до 49,7 дней и приводило к эффективной противоопухолевой активности с 90,27% TGD с неопределенным MST за счет полного удаления опухоли у трех мышей (см. Таблицу 4).

Терапевтическая эффективность препаратов in vivo у самок мышей BALB / c с карциномой толстой кишки C26. Мышам вводили внутривенную инъекцию однократной дозы составов (10 мг / кг). а Представляет соответствующий процентный профиль веса BALB / c в каждой экспериментальной группе. б Изображает размер опухоли у мышей BALB / c. c Показывает график выживаемости для BALB / c. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n =5)

Данные о размере опухоли продемонстрировали, что ED-lip может резко подавлять рост опухоли. Результаты анализа выживаемости показали, что лечение ED-lip увеличивало MST и TTE. Группа, получавшая ED-lip, имела больший TGD% и была более эффективной по сравнению с Caelyx®. Наши результаты согласуются с высоким уровнем концентрации DOX в опухолевой ткани в группе, получавшей ED-губу. Следовательно, липосомный DOX, конъюгированный с аптамером, улучшает их проникновение и, следовательно, увеличивает накопление лекарственного средства в опухолевом участке, что, в свою очередь, приводит к повышению эффективности Caelyx® и более высокому TGD% в данных о выживаемости. Взятые вместе, эти данные указывают на то, что аптамеры против EpCAM могут служить важным нацеливающим агентом для доставки лекарств.